牙齿酸蚀症实验室评估技术的研究进展

袁 鹤 综述;李继遥 审校

(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，四川成都 610041)

牙齿酸蚀症(tooth erosion)是指在无细菌参与的情况下，由于单纯的化学作用而引起的牙齿硬组织不可逆的丧失［1］，其致病机制尚未完全明了，可由外源性和内源性因素造成。外源性致病因素包括食用酸性物质、饮料、食物、药物和酸性环境的暴露;内源性致病因素包括胃内容物返流引起的复发性呕吐等全身性疾病［2－4］。此外，宿主的生物学因素，如唾液、获得性膜的形成、牙齿的结构、牙齿与软组织的关系以及舌的运动等也可能影响牙齿酸蚀症的发生发展［5］。当前的流行病学调查和实验室研究均证明，大量饮用软饮料能增加牙齿酸蚀症发生的危险性［6－14］。牙齿酸蚀症病人最初往往仅有牙齿的感觉过敏，以后逐渐产生实质缺损，酸蚀的形式因酸而异［15］。不同学者对牙齿酸蚀症的临床表现看法不一，Ganss［16］对目前根据临床表现诊断牙齿酸蚀症的有效性进行分析后指出:前牙的沟槽状缺损不能用于诊断牙齿酸蚀症;釉牙骨质界冠方浅碟状缺损以及存在于青年人牙尖的杯状凹陷性缺损可以作为诊断牙齿酸蚀症的依据。

牙齿酸蚀症的实验室评估主要是通过测量酸蚀过程中牙齿硬组织或羟磷灰石的丧失来提示酸蚀介质的酸蚀潜力(erosive potential)。酸蚀潜力与酸蚀介质的多种因素有关，如pH值，缓冲能力(即滴定酸度)，对牙面的粘着性，螯合性，钙、磷、氟等矿物质离子的浓度等［5］。因此，评估方法也众多，本文就其实验室评估技术的研究进展作一综述。

1 化学方法(Chemical analysis)

是一种通过测量酸蚀介质处理标本前后pH值、缓冲能力、Ca2+或磷酸根浓度以及某些微量元素的变化，以评估酸蚀潜力的方法。具体方法是将牙齿硬组织或羟磷灰石暴露于酸蚀介质一段设定的时间后，对酸蚀介质进行分析，测量前后的浓度变化越大说明酸蚀潜力越强。

化学方法评估酸蚀潜力简单易行，无需制备标本，实验成本低，可实时比较不同处理时间下各种酸蚀介质的酸蚀潜力，且敏感性高，可以测得离子含量的微小变化，因此应用十分广泛。如，Eisenburger［14］分别使用原子吸收光谱法和钼酸铵法测得在3 g/L柠檬酸酸蚀后，软化脱矿的釉质区Ca2+和磷酸根含量分别减少62%和64%。pH值和缓冲能力的测量多在研究初始阶段应用pH计和酸碱滴定法进行，用于反映酸蚀介质的特性，许多文章都证实软饮料的pH大大低于釉质溶解的临界pH 值 5.0 ～5.5［11－13，17－19］。

但化学方法只能反映离子改变的净效应，是一种间接测量方法，不能模拟口腔内牙齿酸蚀症发生时，由于宿主生物学因素的存在而引起的牙体硬组织脱矿减少或发生再矿化的情况。

2 物理方法(Physical analysis)

2.1 轮廓测量法(Profilometry)

对牙齿硬组织包埋、开窗制成标本，实验处理后，使用轮廓测量仪直接测量、比较开窗区和保护区的表面形态，得到标本表面垂直方向的丧失，从而评估酸蚀介质的酸蚀潜力。是一种简单快捷的评估酸蚀潜力的方法，可测量较大面积牙齿硬组织表面的酸蚀情况。Rios等［18］曾将此法用于测量不同种类可乐对釉质造成酸蚀后，开窗区釉质丧失的深度。

但是，该方法也存在着不少缺点。Ren等［20］发现轮廓测量仪金属触针的大小影响其测量精度。Heurich等［21］也发现该方法会使釉质表面产生划痕，从而造成对酸蚀潜力的过分评估。且该方法对牙齿酸蚀症早期软化的釉质表面无测量效果;标本制备的要求较高。最近提出的激光轮廓测量法，也称为非接触式轮廓测量法(non－contacting surface profilometry，NCSP)，可弥补接触式轮廓测量法的不足。此法用激光代替了传统的触针，通过光的干涉效应建立起牙齿硬组织表面的“形态地图”，不仅提供了传统方法中牙齿硬组织表面垂直方向的丧失，更能体现其体积的丧失。直观易懂，在釉质表面不产生划痕，激光探头可根据标本的大小进行更换，使测量的标本范围加大。Ablal等［11］应用此法比较了4种不同乙醇饮料的酸蚀潜力。Barbour等［12］应用NCSP发现:酸蚀过程中釉质表面的丧失深度随着酸蚀介质温度的升高而增加。

2.2 印压技术(Indentation)

牙齿酸蚀症的早期表现是釉质的脱矿软化，基于此点，印压技术通过测量酸蚀前后釉质表面硬度的改变评估牙齿酸蚀症。包括显微印压技术(microindentation)和纳米印压技术(nanoindentation)。

该技术使用金刚石探头以一定大小的负荷和速度在釉质表面产生压痕，脱矿软化越明显压痕越大。实验对釉质表面选3～5个点进行测量，可得到釉质表面努氏硬度(KHN)、维氏硬度(VHN)或弹性模量(Nm－2)数据。纳米印压技术能够检测到200 nm深度的软化釉质薄层，同时检测弹性形变和塑性形变，使实验结果更加精确。

该方法应用广泛，Barbour等［12］使用纳米印压技术发现:软饮料温度每升高25℃，造成釉质表面硬度降低 0.9 GPa。Rios等［18］应用显微印压技术比较了不同种类可乐造成釉质表面硬度的改变。Van Eygen等［19］使用显微印压技术发现:即使短时间饮用饮料也可能降低釉质表面硬度，饮用频率不是表面硬度降低的决定因素。

但是，应用该技术时，要求釉质表面平滑且上下两底面平行，需要对釉质标本表面进行打磨，增加了标本制备的难度，打磨还可能对实验结果产生影响。

2.3 图像分析

2.3.1 扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy，SEM)

利用聚焦非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息(如二次电子、背射电子、俄歇电子等)，通过对这些信息的接受、放大和显示成像，获得对试样表面形貌的观察。实验方法是:制备标本，在实验处理前后分别用SEM成像，就可以清晰的观察到釉质表面形态由规则的鱼鳞状秞柱结构变为秞柱或秞柱间质矿物质溶解形成的不规则蜂窝状、点隙状结构，从而评估牙齿酸蚀症。

SEM放大倍数较高，20～20万倍之间连续可调;景深及视野大，成像富有立体感，可直接观察试样凹凸不平表面的细微结构;重复性好。Brown等［13］将羟磷灰石经过调味苏打水、橙汁酸蚀后，用SEM分别观察其表面形态，发现两者造成的酸蚀程度相似，纠正了将调味苏打水作为酸性饮料代用品的错误，为牙齿酸蚀症的预防提出了新的建议。

2.3.2 原子力显微镜(Atomic force microscopy，AFP)

通过检测微悬臂一端极小的针尖与标本之间的原子间作用力，从而获得标本表面的微观形貌信息的技术。常见有接触模式和轻敲模式两种。

此方法可连续动态的检测物体表面的微观信息，获得图像的分辨率高，成像性能好，且不受实验环境(如真空、气体和液体)和标本的限制，应用更加简单方便，精确度高，可检测到标本表面纳米数量级的改变。Heurich等［21］使用AFP为标准，分别测量轮廓测量法和激光共聚焦显微镜在测量酸蚀釉质表面产生的划痕深度，得出激光共聚焦显微镜测量酸蚀症更加精确、快速的结论，体现了AFP在评估牙齿酸蚀症中的优势。

原子力显微镜价格昂贵，每次只能检测小于0.5 mm×0.5 mm的区域，却需要大约60 min的工作时间。由于测量范围过小，为使标本的代表性增强，必须进行多点检测。

2.3.3 X线显微照相技术(Microradiography)

投照于标本的X线，在牙齿硬组织不同厚度和矿物质含量不同的区域透过的量不同，在底片上反映出的亮度也不同，从而得到一张牙齿硬组织矿物质含量的“地图”。包括横断显微照相技术(transverse microradiography，TMR)、纵断显微照相技术(longitudinal microradiography，LMR)和不依赖波长的显微照相技术(wavelength－independent microradiography)。

虽然X线显微照相技术主要用于龋病的研究，但也已经被应用于牙齿酸蚀症的评估。其不仅能测量釉质丧失深度，还能测量缺损下软化釉质矿物质的丧失量，从而得到真正的酸蚀潜力。这也是Elton等［22］将TMR作为金标准比较定量光导荧光技术和NCSP评估牙齿酸蚀症准确性的依据。通过比较得出:前者用于测量软化釉质矿物丧失量时准确性较高，而NCSP用于测量釉质丧失深度时准确性较高。Ablal等［11］应用 TMR等测量技术发现:暴露于4种乙醇饮料不同时间后，牛牙釉质标本均有丧失，丧失程度与饮料的pH值和酸蚀时间直接相关。

2.3.4 定量光导荧光技术(Quantitative light－induced fluorescence，QLF)

离体牙标本酸蚀前后，用微型摄像机摄取图像，分析软件对图像进行分析，得出脱矿釉质的荧光丧失量与正常釉质荧光量的百分比△Q，即△Q=(Fsound－Ferosion)/Fsound×100%，计算得到酸蚀后釉质脱矿的多少，从而比较不同酸蚀介质酸蚀潜力的方法。

该方法无需制备标本，是一种很有潜力的实验室可广泛应用的技术手段。将其应用于评估牙齿酸蚀症也得到了满意效果。Ablal等［11］使用此法得到牛牙釉质标本随4种乙醇饮料酸蚀时间的延长△Q增加，脱矿量增加。而且，QLF是目前唯一可用于临床诊断牙齿酸蚀症的方法:压缩空气吹干牙面后，使用口内摄像头，得到酸蚀牙齿的荧光图像，与参考牙齿的荧光图像进行比较，使用软件对酸蚀后釉质的脱矿程度进行计算和评分。

但是，QLF仅能测得釉质脱矿量的改变，对于釉质的丧失深度无测量效果。故仅用于测量尚无实质缺损的或存在于实质缺损下的软化釉质脱矿量的改变。这一点在Elton等［22］的研究中有所阐述。

此外，也有学者提出了一些评估牙齿酸蚀症的其他方法，如次级离子质谱分析法(Secondary ion mass spectroscopy，SIMS)，可变焦距3D扫描显微镜法［20］，激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)［21］等，其中多种方法有很大的应用潜力，值得比较分析。

3 总结

本文主要讨论了几种广泛应用的实验室评估牙齿酸蚀症的技术。轮廓测量法和显微照相技术主要用于测量进展期牙齿酸蚀症已造成牙齿硬组织丧失时，而对于早期牙齿酸蚀症的评估，主要采用更加敏感的技术，如印压技术，尤其是纳米印压技术。化学方法可测量不同阶段的牙齿酸蚀症，但是其只是一种间接测量方法。扫描电子显微镜常作为其他技术，如印压技术等，无法直接观察牙齿硬组织表面形态改变时的补充手段，仅能得到定性测量的结果。而原子力显微镜拥有定量测量和定性观察表面形态的双重作用，故应用前景更加广泛。而作为唯一一种能够同时应用于临床测量牙齿酸蚀症的定量光导荧光技术，可能会得到更多学者的青睐。

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