低氧诱导因子1α在骨损伤修复中的研究进展

陈小丹，何家才

(安徽医科大学口腔医院，合肥230032)

肿瘤的手术切除、交通伤、感染或其他原因导致的骨缺损，给患者带来结构和功能上的影响。骨组织含血量很大，占心排血量的5%～20%。血液可为骨提供氧气、营养、矿物质、可溶性因子、不同类型的细胞和移走代谢产物，从而维持生长发育。损伤后，血流中断或减少而导致局部缺氧。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)及其目标基因能够调控骨系细胞、诱发长入新血管，从而发挥其在骨缺损修复中的促进作用［4-5］。

1 HIF-1α的生物学特点

1992 年Semenza等［1］在研究低氧下诱导促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)基因转录的低氧诱导增强子的特点中，发现了HIF。低氧条件下，它能激活数百个目标基因的转录。

HIF 由 HIF-α(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和 HIF-β组成，这两个亚单位都是碱性螺旋-环-螺旋结构。HIF-1是目前研究最为透彻的HIF家族中的一种亚型，由HIF-1α和HIF-1β组成。HIF-1α在常氧下很快降解，但低氧时稳定，是相对分子质量为120×103的蛋白质为功能性调节亚基，由826个氨基酸组成。HIF-1的稳定性及其反式激活作用的调节都是通过转录后修饰来控制，如羟基化、乙酰化、磷酸化、亚硝基化修饰。HIF-1α包含:①PAS(PER-ARNT-SIM)、HLH 域是 HIF-α 和HIF-β结合成有活性的HIF-1的结合位点，同时也是介导HIF-1与目标基因上的低氧反应元件结合的部位。②氧依赖降解域参与常氧下细胞内HIF的降解和低氧下的稳定性和活性［2］。常氧下，位于此区域的402和564的脯氨酸在脯氨酸羟化酶［3］以及氧、铁、2-酮戊二酸的辅助因子的共激活下羟基化，位于532的赖氨酸乙酰化后，均能为肿瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，VHL)识别并可与HIF-1结合，之后与E3泛素连接酶结合而形成脯氨酸-VHL-E3复合体，最后被蛋白酶体降解。低氧下，一些中间代谢产物或铁抑制脯氨酰羟化酶的活性，从而使HIF-1α表达稳定，并移入细胞核内与HIF-1β结合成HIF-1异源二聚体。③C末端转录激活域(C-terminal activation domain，C-TAD)和N末端转录激活域(N-terminal activation domain，N-TAD)是转录激活区调节HIF的转录活性。HIF-1α的N-TAD和C-TAD受不同机制调节。C-TAD为 HIF-1α基因转录激活所必需，而N-TAD在功能上似乎不是必要的。常氧下，位于C-TAD上的803位天冬氨酸被天冬氨酸羟化酶FIH-1羟基化，限制了HIF与p300/CBP的结合，从而阻碍HIF-1α的降解，两区域之间是结构抑制域，对转录激活区域有负调控作用。④核定位信号序列是低氧条件下调节HIF-1α转移入核的特殊碱基序列。

2 HIF-1α对血管生成的调控

HIF-1α是启动血管形成的核心调控因子，通过调控靶基因参与血管形成，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与血管生成素2、整合素共同作用，形成血管芽，随后形成血管腔;调控一氧化氮合酶2、内皮素1等控制血管的紧张度;诱导基质金属蛋白酶、纤溶酶原活化因子受体和抑制子等参与基质代谢和血管的成熟;EPO促进红细胞生成、增加微血管的密度。然而，HIF-1α对VEGF和EPO的调控最为重要。VEGF与VEGF受体1、VEGF受体2结合后能促进内皮细胞分裂、增殖，向低氧和乏血管区迁移，降解细胞外基质来参与血管的形成。陈博等［4］用HIF-α基因转染大鼠的骨骼肌细胞后可增加具有正常功能的VEGF蛋白的分泌，促进血管内皮细胞的增殖。Li等［5］研究发现，与VEGF表达增强的野生型HIF-1α组比较，不表达VEGF HIF-1α剔除组鼠胚胎成纤维细胞的迁移明显降低。Geiger等［6］在兔桡骨缺损处植入VEGF165-活化基因基质后用免疫组织化学染色法显示VEGF组的血管生成量是对照组的2～3倍。EPO通过促进内皮细胞增殖、迁移，上调VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)，增加血小板对微血管的黏附能力及其活性以促进血管的发生。Kawachi等［7］在猪的心肌梗死试验中发现，与对照组比较，EPO组有大量血管形成，且HGF、FGF、IGF、VEGF 表达升高，同时诱导前体内皮祖细胞向缺血区迁移促进血管的发生。Kato等［8］通过建立小鼠后肢局部缺血模型发现，与磷酸盐缓冲液治疗相比，EPO治疗组恢复了血流，黏附血小板的微血管密度和可溶性血小板上P选择蛋白增加，中和P选择蛋白后血流受损，黏附血小板的微血管密度降低。

3 HIF-1α对成骨细胞的调控

HIF-1α有利于恢复低氧环境中成骨细胞增殖活性，加快其增殖速率，增强成骨功能。第一，直接调控:HIF-1α促进成骨细胞骨钙素(osteocalcin，OC)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表达，OC由成骨细胞合成分泌，是评价骨形成、骨转换和成骨细胞活性的特异性指标，在骨矿化中起重要的作用。ALP是成骨细胞早期分化的标志。第二，通过其他基因间接调控:①VEGF的调控直接影响前体成骨细胞，促进成骨细胞的分化和增强再生骨的矿化。②IGF1和IGF2，目前发现IGF1更有潜能，它能够促进成骨细胞的增殖和分化并最终增加骨基质的生成以及OC和ALP的合成，同时它对前体成骨细胞和成熟破骨细胞还有抗凋亡保护作用。IGF2能够调节间充质干细胞向成骨细胞分化。③转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族包括TGF-β、骨 形 成 蛋 白 (bone morphogenetic protein，BMP)两个亚家族，主要是由成骨细胞和血小板产生。TGF-β信号能促进前体成骨细胞的增殖、早期分化和基质的产生。BMP 中的 BMP-2、-4、-5、-6、-7都具有很强的成骨能力，BMP-2能大大增加OC的表达，诱导成骨细胞的分化，是强有力的成骨性分化因子。BMP-7能诱导ALP的表达和促进基质矿化。④骨特异性转录因子RUNX2，RUNX2的两个主要亚基是T1和T2，对成骨细胞的分化和成熟具有重要的意义。T1 RUNX2在早期的前体成骨细胞中表达，能促进BMP2的形成，BMP2刺激T2 RUNX2的产生，继之促进成骨细胞的分化和成熟。RUNX2与HIF-1α共同存在前体成骨细胞的胞核内，两者在结构和功能上协同促进成骨作用。第三，诱导血管形成间接调控:增加的血管侵入骨组织，能够提供成骨性因子和运送前体成骨细胞，进而启动成血管和成骨作用的级联反应。

此外，HIF-1α可刺激外周血的单核细胞向成骨细胞分化［9］。Shomento等［10］研究发现，HIF-1α 缺失鼠的松质骨体积明显减少，骨形成的速度延缓，同时成骨细胞的增殖减慢。刘晓东等［11］研究证实，与21%O2相比，2%O2时成骨细胞的HIF-1α和VEGF表达增加，OC水平增高，同时成骨细胞增殖、碱性磷酸酶分泌以及钙结节形成能力也逐渐增强。另外，激活成骨细胞的HIF-1α信号通路能有效地对抗雌激素降低引起的骨缺失［12］。

4 HIF-1α对破骨细胞的调控

破骨细胞是负责骨吸收的多核细胞，来源于循环系统中单核巨噬细胞系的造血前体干细胞，为氧感应细胞。HIF-1α主要是通过靶基因VEGF、Bcl-2/腺病毒E1B 19×10结合蛋白3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、血管生成素4等间接调节破骨细胞活性和分化，增加其骨吸收能力。核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是破骨细胞分化和成熟的必要条件［13］。低氧时VEGF表达，它能替代M-CSF促进破骨细胞的分化，募集单核细胞和破骨细胞，并支持破骨细胞的存活和活性［14］。其机制为VEGF激活单核细胞的VEGF受体1，从而刺激单核前体破骨细胞的迁移;VEGF与激活的VEGF受体1结合使前体单核细胞表达细胞核因子κB受体活化因子，并与成骨细胞上的RANKL结合来促进单核破骨细胞分化;破骨细胞自身分泌的VEGF与VEGF受体2结合后反过来支持自身的存活和活性;HIF-1α通过下游基因BNIP3来调节破骨细胞的自噬作用。Dandajena等［15］把外周血单核细胞和成骨细胞共培养发现，只有低氧时成骨细胞的HIF、VEGF和RANKL表达上调时才能观察到破骨细胞。说明单核细胞向破骨细胞分化与RANKL、HIF、VEGF紧密联系。HIF-1α对破骨细胞功能的调控部分是通过血管生成素4调节破骨细胞活性来实现的，后者通过激活不同的细胞内信号通路来增强破骨细胞的活性［16］。Zhao等［17］研究发现，低氧通过HIF-1α/BNIP3调控前体破骨细胞的自噬作用使其胞质内容物降解和结构调整以形成破骨细胞，此外HIF-1α对软骨细胞的存活、增殖、分化和软骨基质的形成也有非常重要的影响［18］。HIF-1α可以促进间充质干细胞向成骨性细胞系分化，并且增加ALP的活性和Ⅰ/Ⅲ型胶原的产生［19］。

5 结语

HIF-1α与血管发生、成骨细胞、破骨细胞的调控紧密相关。新生血管可以向骨损伤处输送成骨细胞和前体破骨细胞，血管内皮细胞还能诱导间充质干细胞分化为成骨细胞系。此外，血管生成因子(如VEGF)通过刺激内皮细胞产生成骨性生长因子调节骨祖细胞的募集，成骨细胞的增殖、分化及破骨细胞的活性。

骨缺损修复依然是临床上面临的一个严峻的挑战，不论是自体骨还是异体骨移植都有来源受限、损害供体部位和免疫排斥反应等问题，HIF-1α在骨缺损修复中具有重要的促进作用。然而，它受多因素调控，如何在时间、量上控制它，使其最有利于骨生成，又不会出现不良反应，还需要进一步研究。同时HIF-1α对一些骨系细胞功能的调控还有许多问题没有得到证实，快速形成新的脉管网络也依然是个挑战。HIF-1α在血管再生方面有很突出的优势，但它在常氧下易分解，因此目前很多实验研究通过基因工程来稳定HIF-1在常氧下表达，并与骨组织工程技术联合应用，从而为骨缺损的治疗提供一个新的途径。

［1］Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Bol，1992，12(12):5447-5454.

［2］Tseng WP，Yang SN，Lai CH，et al.Hypoxia induces BMP-2 expression via ILK，Akt，mTOR，and HIF-1 pathways in osteoblasts［J］.J Cell Physiol，2010，223(3):810-818.

［3］Baldewijns MM，van Vlodrop IJ，Vermeulen PB，et al.VHL and HIF signalling in renal cell carcinogenesis［J］.J Pathol，2010，221(2):125-138.

［4］陈博，陈剑秋.HIF-1α转染骨骼肌细胞的诱导产物VEGF对血管内皮细胞增殖的影响［J］.天津医科大学学报，2010，16(3):420-423.

［5］Li L，Madu CO，Lu Y，et al.HIF-1α Promotes A Hypoxia-Independent Cell Migration［J］.Open Biol J，2010，3:8-14.

［6］Geiger F，Bertram H，Berger I，et al.Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix(VEGF165-GAM)enhances osteogenesis and angiogenesis in large segmental bone defects［J］.J Bone Miner Res，2005，20(11):2028-2035.

［7］Kawachi K，Iso Y，Sato T，et al.Effects of erythropoietin on angiogenesis after myocardial infarction in porcine［J］.Heart Vessels，2012，27(1):79-88.

［8］Kato S，Amano H，Ito Y，et al.Effect of erythropoietin on angiogenesis with the increased adhesion of platelets to the microvessels in the hind-limb ischemia model in mice［J］.J Pharmacol Sci，2010，112(2):167-175.

［9］Dandajena TC，Ihnat MA，Disch B，et al.Hypoxia triggers a HIF-mediated differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts［J］.Orthod Craniofac Res，2012，15(1):1-9.

［10］Shomento SH，Wan C，Cao X，et al.Hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha exert both distinct and overlapping functions in long bone development［J］.J Cell Biochem，2010，109(1):196-204.

［11］刘晓东，邓廉夫，王君，等.低氧诱导因子-1α对成骨细胞功能的调控作用［J］.上海交通大学学报:医学版，2007，3(27):298-302.

［12］Zhao Q，Shen X，Zhang W，et al.Mice with increased angiogenesis and osteogenesis due to conditional activation of HIF pathway in osteoblasts are protected from ovariectomy induced bone loss［J］.Bone，2012，50(3):763-770.

［13］Kim AR，Kim HS，Lee JM，et al.Arctigenin suppresses receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)-mediated osteoclast differentiation in bone marrow-derived macrophages［J］.Eur J Pharmacol，2012，682(1/3):29-36.

［14］Knowles HJ，Athanasou NA.Hypoxia-inducible factor is expressed in giant cell tumour of bone and mediates paracrine effects of hypoxia on monocyte-osteoclast differentiation via induction of VEGF［J］.J Pathol，2008，215(1):56-66.

［15］Dandajena TC，Ihnat MA，Disch B，et al.Hypoxia triggers a HIF-mediated differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts［J］.Orthod Craniofac Res，2012，15(1):1-9.

［16］Knowles HJ，Cleton-Jansen AM，Korsching E，et al.Hypoxia-inducible factor regulates osteoclast-mediated bone resorption:role of angiopoietin-like 4［J］.FASEB J，2010，24(12):4648-4659.

［17］Zhao Y，Chen G，Zhang W，et al.Autophagy regulates hypoxia-induced osteoclastogenesis through the HIF-1α/BNIP3 signaling pathway［J］.J Cell Physiol，2012，227(2):639-648.

［18］Araldi E，Schipani E.Hypoxia，HIFs and bone development［J］.Bone，2010，47(2):190-196.

［19］Huang J，Deng F，Wang L，et al.Hypoxia induces osteogensis-related activities and expression of core binding factor α1 in mesenchymal stem cell［J］.Tohoku J Exp Med，2011，224(1):7-12.