鸭瘟病毒研究进展

徐晓娟综述 郭霄峰 魏平华审阅（华南农业大学兽医学院 广州 5064 广州格雷特生物科技有限公司 广州 50730）

鸭瘟（Duck Plague,DP），又名鸭病毒性肠炎（（Duck Virus Enteritis,DVE），是鸭、鹅和其他雁形目禽类的急性、热性和败血性传染病，是目前对世界范围内水禽养殖业危害较为严重的疫病之一[1]。该病已被世界动物卫生组织认定为B类传染病，我国动物防疫法也将其列入二类动物疫病[2]。荷兰学者Baudet[3]于1923年首次发现该病后，其流行范围逐步扩大，相继在法国(1949)、美国(1950)、印度(1963)、比利时(1964)、英国 1972)、泰国(1976)和加拿大(1976)被发现。1957年，黄引贤在我国广州报道发现了鸭瘟。1957～1965年，本病广泛流行于我国南部、中部和东部的一些养鸭业较为发达的省市[4]，1983年廖德惠报道了四川省存在鸭瘟，并且分离到鸭瘟病毒。至今，全国各地均有本病的报道。目前，鸭瘟仍然是阻碍我国养鸭业发展的重要传染病之一。

1 鸭瘟病毒基本特性

DP的病原是鸭瘟病毒（DPV），又名鸭病毒性肠炎病毒（DEV），属疱疹病毒科、疱疹病毒亚科，也称鸭疱疹病毒Ⅰ型(Duck hcrpcsivirusⅠ)[5]，是一种泛嗜性全身性感染的病毒。

DPV为线性双链DNA病毒，成熟病毒粒子直径150～380nm，呈球形，有囊膜，在CsCl中浮密度为1.272g/mL，无血凝特性和血细胞吸附作用。除有芯髓、衣壳、囊膜等常见结构外，在衣壳和囊膜间还有疱疹病毒所特有的皮层成分[6]。DPV各毒株在毒力上存在差异，但在免疫学特性上却是相同的，迄今为止，只发现一种血清型。该病毒对热、pH及脂溶剂（乙醚、氯仿等）均较敏感，56℃10 min会丧失感染力，80℃5 min即可死亡，在pH3和pH11的环境下也很快被灭活[7]。

2 鸭瘟病毒粒子结构

DPV完整的病毒粒子由芯髓 (core)、衣壳（capsid)、囊膜（envelope）及衣壳和囊膜间的皮层结构（又称外膜）所组成。病毒芯髓由蛋白与双股DNA缠绕而成，在衣壳内致密排列，直径约为35～40nm，也有报道称为74nm。衣壳为对称二十面体，表观呈现正六角形，它由162个相互连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒组成，是疱疹病毒最重要的形态特征。芯髓与衣壳一起被称为核衣壳或裸露的病毒子，直径约为95～105nm。核衣壳穿过宿主细胞核膜进入胞浆或其空泡中，外面包上一层由蛋白质组成的疱疹病毒所特有的皮层成分，最后绕以囊膜形成成熟的病毒子。余克伦[7]等在电镜下观察纯化的DPV直径为184nm,核衣壳直径92nm,而芯髓在衣壳内排列致密，直径为74nm，衣壳外包有明显的囊膜，还可见到多量的囊膜融合的双病毒颗粒和四病毒颗粒。2008年，郭宇飞等[8]的电镜负染观察结果表明，病毒粒子呈圆形,多数直径为150 nm左右,只有1个核衣壳,少数病毒粒子直径可达300 nm,有2个或多个核衣壳。

3 鸭瘟病毒的装配与释放

经研究报道，DPV可在9～14日龄鸭胚中生长繁殖，并引起胚胎死亡。病毒在鸭胚生长适应以后还可感染鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生蚀斑并形成核内包涵体。DPV还可在成纤维传代细胞系CCL-141中生长并具有蚀斑易于观察的特点,但病毒产量较原代细胞少5.6倍[32]。有研究报道，1株DPV弱毒接种鸭胚成纤维细胞后，对其生长情况进行的研究结果表明，接毒后4 h可在胞内检测到DPV，在48h病毒滴度达到最高；接毒后6～8 h可在胞外检测到DPV，在60h病毒滴度达最高，病毒在细胞内的复制周期为6～8 h，成熟病毒子的释放与细胞发生病变的时间相一致。丁明孝[9]的研究结果进一步证实，DPV DNA的合成是持续进行的，被感染细胞中，病毒DNA的复制与壳体的装配，病毒粒子的成熟与释放是同时进行的。对DPV弱毒株在鸡胚成纤维细胞中的成熟和释放方式进行研究发现，DPV获得囊膜的方式有2种:一是核衣壳可通过空泡出芽的方式获得囊膜；二是在核内依靠膜物质在核衣壳周围积累而获得囊膜。深入研究结果表明，DPV存在2种装配方式:（1）病毒核衣壳进入宿主细胞后，在核内获得皮层蛋白，部分核内膜形成囊膜从而成为成熟病毒子，称为胞核装配方式；（2）核衣壳通过内外核膜进入胞浆，在其中获得皮层蛋白，然后通过向高尔基体或者内质网腔出芽释放时获得囊膜形成成熟病毒子释放到细胞外，称为胞浆装配方式[10,11]。前者是DEV核衣壳主要的装配方式。但是，翟中和等[12]通过大量的观察和应用电子显微镜放射自显影技术，证明了DPV第二种装配方式的存在，即在细胞质内的装配过程。其后丁明孝[9]也观察到DEV在细胞质中的成熟过程。DEV的复制过程，特别是在病毒复制的前期阶段，比如基因的转录、蛋白合成以及DNA复制等仍然缺乏详细的资料。

4 鸭瘟病毒基因组结构及分子生物学研究

4.1 DPV 基因组结构

DPV的DNA与其他α-疱疹病毒基因组结构相似，整个基因组由 UL（unique long）区和 US(unique short)区组成，中间有 IR（internal repeat）区相隔，两端有 TR（terminal repeat）区相连。Ying Wu 等[13]对 DPV CHv株全基因组测序结果表明，该株DPV基因组全长由162175个核苷酸组成，G+C含量为44.89%，与之前报道的DPV基因组G+C含量64.3%不同。该毒株5’UTR长为5685bp，包含25个TATA盒、8个 CAAT盒、8个 poly(A)尾和 1个 GC盒，而 3’UTR则分别包含3个TATA盒、13个CAAT盒、4个poly(A)尾和7个GC盒，一般认为它们均在一定程度上调控基因的转录水平。同时，3’UTR拥有7个串联重复序列，其长度达到40nt，可定义为小卫星。

4.2 DPV分子生物学研究

相对于疱疹病毒科其他成员，人们对DPV基因组的研究起步较晚。1998年，Plummer等用HindⅢ消化DPV得到约1.95kb的DNA片段，对该片段测序分析结果表明，该片段与水痘带状疱疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）的 UL6 和 UL7 部分基因同源[14]。随后，Hansen等[15]报道了DPV UL30基因的部分序列。2002年，郭霄峰的研究表明:DPV的UL6和UL7基因在不同毒株中高度保守[16]。随着对DPV基因组结构的深入研究，多个DPV基因现已被成功克隆并进行了序列分析。韩先杰等[17]利用兼并PCR的方法成功克隆了DEV完整的TK、gH、UL24基因和UL25、UL26基因的部分序列，同时实现了gH部分基因、UL24及TK基因在大肠杆菌内的表达；并首次以DEV TK基因作为同源重组的区域，将LacZ基因表达盒插入TK基因内构建鸭瘟病毒转移载体，为以鸭瘟病毒为载体构建重组鸭瘟病毒活载体疫苗创造了条件。文明[18]等应用鸟枪法成功构建了DPV基因文库，获得大于100bp的ORF共187个，首次克隆并鉴定了DPV的核衣壳蛋白基因。陈淑红[19]、高亚东[20]等研究者应用靶基因步移PCR法分别获得DPV部分基因的完整ORF，研究结果均指向DPV应归类为α-疱疹病毒亚科的马立克氏病病毒属。李阳[21]分别以DPV UL35、UL50和SORF3部分基因为七点设计引物，扩增出DPV基因组未知序列UL36、UL51～UL55、US2 和 US3。Yan Zhao 等获得了 DPV US10、US2、US3、US4和US5并对这些基因进行了分子水平上的分析，认为DPV与α-疱疹病毒亚科的同源关系最近。

随着基因组序列的深入研究，相关基因的功能研究也逐渐开展起来。李慧昕表达了UL27基因中段UL27-MHE UL6基因的UL6-1和UL6-2两段，应用Western Blotting和间接免疫荧光方法进行了检测，并制备了针对UL19-C段蛋白的单克隆抗体，拟对UL19抗原表位进行初步定位。潘华奇以纯化的重组gB1蛋白作为包被抗原，初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA。孙涛等对DPV UL6基因B细胞表位进行了预测以及对其主要抗原域进行了原核表达，以兔抗DPV多克隆抗血清进行Western Blotting分析，多抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。刘峰源对不含信号肽部分的gC基因胞外区进行了原核表达，并证明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位并且能够刺激机体的细胞免疫。金映红［21］将DEV gH蛋白切除信号肽和跨膜区而保留抗原区的截断蛋白获得有效表达，且重组蛋白能与疫苗免疫的DEV阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原反应原性，采用以此表达产物作为抗原建立DEV的血清学检测方法和研究DEV感染过程中gH的作用研究奠定了基础。李子剑将绿色荧光蛋白插入到DPV基因TK、US2、US1和US10，证明这四个基因为DPV复制非必需区[22]。

5 分子生物学诊断方法

随着现代分子生物学的迅速发展，鸭瘟病毒的诊断已经从传统的诊断方法过渡到如今的分子生物学方法。目前主要利用抗原抗体反应和分子检测方法对该病作出正确诊断[23]。

现代分子生物学方法包括聚合酶链式反应（PCR）、微量固相放射免疫试验(Micro-SPRIA)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和斑点杂交(Dot-hybridization)等。近来，郭宇飞等[9]建立了用电镜负染检测鸭瘟病毒的方法。随后，Renyong Jia[24]等建立了有效检测鸭瘟病毒UL24蛋白的抗原捕获酶联免疫吸附法(AC-ELISA)，Chanjuan Shen[25]等又研制出检测鸭瘟病毒的免疫胶体金层析试纸条。

PCR检测DPV方法的建立，是在成功获得了DPV部分保守基因片段核酸序列的基础上发展起来的，Plummer等［14］于 1998年首次成功利用该方法检测到鸭瘟病毒(DPV)DNA，并且确定了PCR的最低检测量为1fg，整个实验过程仅需36～48h。随着研究者们的深入研究，目前，应用该方法能够检测到1pg[26]甚至0.1pg[27]的病毒DNA，并且检测时间缩短至12h。2006年，汤承等[28]开发成功的SYBR GreenⅠ实时定量PCR(real-time PCR)检测技术将检测时间缩短至3h,对本病的快速诊断具有极其重要的作用。该方法由于其敏感、特异、简便和快速等特点，对于隐性带毒状态禽类的检测具有重要意义，目前已有应用该方法对鸭群进行检疫的报道[29]。但是，PCR检测方法需要较昂贵的仪器和试剂，并且在进行血液检测时，偶尔会出现严重的拖尾现象，影响结果的判断，此外，还要求兽医工作者具有良好的操作技能，因此，该方法不适宜在基层推广。

微量固相放射免疫试验（Micro-SPRIA）的原理是抗原抗体结合反应,该技术是利用表面能吸附抗体的塑料或其他材料作为固相载体，用同位素标记抗体或抗原，以测定相应抗原或抗体的一种微量检测技术[30]。该技术广泛应用于各种病原的检测，徐耀基等[31]于1992年便开始使用Micro-SPRIA检测DPV，该方法可直接检测肝、脾、脑及血清等病料，人工发病48h后陆续从病鸭、鹅的肝、脾、脑及血清等材料中检出DPV，其中肝、脑的检出率为80%，最高可达到100%。它能够在感染DPV的鸭鹅刚出现体温升高特征性症状和病变尚未出现之前对该病进行检测，适宜发病早期的诊断。Micro-SPRIA特异性强、敏感性高、快速和经济，标记抗体对抗原纯度要求不高，可广泛应用于微量可溶性抗原、抗体的检测，对疫情监测和交通口岸的鸭检疫具有重要的应用价值。

ELISA方法用于DPV病原检测具有简便、快速、敏感、特异等优点,能在临床症状出现之前从肝、脾、粪便和血液中检出DPV,采集的病料只需经过匀浆、冻融和离心等步骤处理后即可用于检测,适宜于对该病的检疫和早期诊断[32]。目前已有多种商品化的间接ELISA检测鸭瘟的试剂盒面市，特别适用于对大批血清样品ELISA效价的检测。

抗原捕获ELISA（AC-ELISA）方法是利用两种纯化后的抗体通过夹心作用捕获样品中的相应抗原从而达到检测目的的一种方法，该方法快速、敏感、特异及可靠。2009年，Renyong Jia[24]等建立了有效检测鸭瘟病毒UL24蛋白的抗原捕获ELISA方法，该方法建立在重组DPV UL24蛋白多克隆抗体的基础上，对人工感染的病鸭血清进行检测，最低检出量为46ng/100μL。试验结果表明，AC-ELISA能特异性检测到DPV，并且与其他病毒或菌株无交叉反应性，对鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭疫里默氏杆菌（R.A.）、大肠杆菌（E.coli）、巴氏杆菌（P.M.)以及肠炎沙门氏菌（S.E.）的检测结果均为阴性，与PCR和病毒分离试验的阳性符合率为100%。AC-ELISA方法能够短时间内准确、快速地直接检测大批量样品中的DPV抗原,明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，而且具有半自动化的特点,能自动显示结果，更适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。

胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。其原理是:以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带),运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的实验现象(显色)。2010年，Chanjuan Shen[25]等首次制成检测血液样品中DPV抗体的免疫胶体金快速诊断试纸，试验中，以纯化的重组DPV UL51蛋白和羊抗兔IgG作为示踪标记物，对人工分别感染多种鸭病原微生物的鸭血清进行检测，结果表明，该免疫层析试纸条能够特异性检测到DPV 抗体，对 DHV，R.A.，E.coli，MPV，鸭流感病毒（DIV)的检测结果均为阴性。同时，将血清样品按1:128的比例稀释时，检测结果仍呈现阳性，表明其敏感性高。对110份DPV阳性血清样品同时用GICA、ELISA和NT 3种方法进行检测，结果表明，GICA方法的敏感性与ELISA方法相当，但远远高于血清中和试验（NT），并且该方法经济、快速（10～15分钟即可显示结果）、易于操作、不需要特殊的仪器设备。胶体金免疫层析技术是在酶免疫结合试验的基础上发展起来的，作为当今检测病原体敏感的免疫学技术之一,不仅操作简便、快速、特异,更为重要的是适用于广大基层单位，并能在现场作检测。

6 疫苗研制

目前，对于鸭瘟尚无特效药物治疗，为防止该病的发生，鸭场必须建立健全合理的管理制度及卫生防疫制度，同时，在综合防制的基础上，重点进行疫苗预防。目前，能用于DP预防的疫苗分为灭活疫苗和弱毒疫苗两大类，其中的灭活苗包括脏器灭活疫苗、鸡胚灭活疫苗、鸭胚灭活疫苗等，弱毒苗包括鸡胚化弱毒疫苗、鸡胚化弱毒细胞疫苗、自然弱毒疫苗等。国内通常使用弱毒疫苗对鸭群进行免疫，认为两类疫苗中弱毒疫苗免疫效果更好，使用弱毒疫苗免疫的鸭体仅产生低水平中和抗体，但受强毒攻击时可使鸭体产生明显的血清记忆反应[33]。由于生产需要，一些联苗也相继被开发出来。程安春等[34]于1997年开发出来的鸭瘟-鸭病毒性肝炎弱毒二联疫苗免疫后对本病也具有良好的预防作用，其保护期可达9个月。此外，若种鸭体内具有很高的DPV中和抗体水平，其可通过母源抗体传递作用使下一代雏鸭获得对本病的被动免疫保护，该雏鸭在2日龄和4日龄时对攻毒感染可产生完全的抵抗而13日龄时则产生50%的死亡率,这表明该被动免疫很快消退。使种鸭产生高水平中和抗体的方法是将种鸭暴露于自然感染该病的环境中，因为仅靠疫苗接种难以产生足够水平的中和抗体。Sarmah等[35]报道，DPV弱毒株接种后18 h尚无保护作用,24h后即出现70%的攻毒保护率,推测疫苗株对强毒株的免疫干扰作用是该保护力迅速产生的原因。

目前的DPV弱毒疫苗，都需做肌肉或皮下接种，这对大群免疫极不方便。因此学者们都在致力于口服弱毒疫苗的研制。另外，研制鹅用的DEV疫苗也是当前的一个课题。

随着DNA重组技术的发展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速发展，其中重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。DPV作为疱疹病毒同样具有充当基因工程疫苗载体的条件，韩先杰等[17]以DEV TK基因作为同源序列成功构建了转移载体，为进一步构建重组病毒活载体疫苗搭建了物质平台。邢明伟[36]分别构建了含有AIV H7 HA和H9 HA基因的重组DPV转移载体，将为重组病毒疫苗的研制奠定基础。

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