鸭肝炎病毒研究进展

阳佑天综述 郭霄峰 魏平华审阅（ 华南农业大学兽医学院 广州 5064 广州格雷特生物科技有限公司 广州 50730）

鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)是雏鸭的鸭病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis,DVH)的病原。该病特点为发病急、病程短、传播快和病死率高，临床表现为角弓反张,剖检见肝肿大和大量出血性斑点。鸭肝炎病毒有3个不同的血清型，即血清Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，它们之间无交叉中和反应和交叉保护作用[1]。鸭肝炎病毒常与其他病毒、细菌混合感染，是危害养鸭业的主要疾病之一。

1 历史与分布

1945年，Levine和Hofstad首先发现Ⅰ型鸭病毒性肝炎，但没有分离到病原。1949年春，Levine和Fabricant对发生在纽约长岛的白色北京鸭雏的一种高度致死性疾病进行了研究，1950年用鸡胚分离到病毒[2]。此后在英国、加拿大、德国、意大利、印度、法国、苏联、匈牙利和日本等国陆续报道了该病的流行。Ⅰ型病毒性肝炎呈世界性分布，我国南京农业大学和北京农业大学通过病毒中和试验和血清被动保护试验，证实我国流行的鸭肝炎病毒属I型[3]。

1965年在英格兰的诺福克（Norfolk）首次报道了雏鸭暴发Ⅱ型病毒性肝炎。发病鸭群已免疫过Ⅰ型DHV弱毒，雏鸭交叉免疫保护实验表明，此次暴发的病原与Ⅰ型鸭肝炎病毒不同，命名为Ⅱ型鸭肝炎病毒。该病原引起的DVH仅在英格兰East Anglia地区有报道，而且自1980年代中期暴发后，该地区也未见有本病发生。

Ⅲ型鸭肝炎病毒由Toth首次在纽约长岛报道。目前只知道美国发生过这种由Ⅲ型鸭肝炎病毒引起的DVH[2]。

2 病原特征

Ⅰ型鸭肝炎病毒最初属微RNA病毒科肠病毒属成员。后来，研究发现DHV与小RNA病毒科9个已知属23种病毒之间的衣壳蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%，故它们应属于小RNA病毒科的一个新属，ICTV小RNA病毒研究组建议称之为禽肝病毒属(Avihepatpvirus)[4]。该病毒大小为20～40nm，无囊膜，基因组为单分子线状正链RNA，含有VP1、VP2和VP33种结构蛋白。其中VP1区存在多个免疫优势辅助性T细胞抗原位点及其抗原决定簇，构成主要的T、B淋巴细胞抗原表位，诱导机体产生中和抗体，且与病毒基因型和血清型的多样性有关[5]。因此VP1常作为病毒遗传变异分析的参考依据。N-DHV具有与DHV-Ⅰ相似的分子结构,但其基因组比DHV-Ⅰ稍大[6]。病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶及常用消毒剂等有一定的抵抗力，能耐受pH 3.0的酸性环境，具有一定的热稳定性。DHV-Ⅰ不能凝集任何动物或人的红细胞,病毒可在鸭胚、鸡胚和鹅胚的绒毛尿囊腔内增殖[1,3]。在DHV-Ⅰ细胞培养方面，1996年，罗函禄[7]首次在国内使DHV适应鸡胚成纤维细胞(CEF)的培养。已有的研究结果表明，鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞和鹅胚肾细胞等均能支持该病毒的生长[8]。但犊牛血清对DHV增殖具有明显的抑制作用,因此，仅有少数报道描述了该病毒的细胞培养[9]。

Ⅱ型鸭肝炎病毒属于星状病毒科星状病毒属，暂命名为鸭星状病毒。该病毒呈球形，因在电镜下呈现特征性的带有顶角的星形，而得此名。直径为27～30nm,基因组为单分子线状正链RNA。病毒可耐受氯仿、pH3、胰酶处理和50℃加热1h。甲醛熏蒸消毒和标准的消毒措施可消灭污染圈舍中的病毒[1,2]。

Ⅲ型鸭肝炎病毒分类同Ⅰ型鸭肝炎病毒，其形态、大小、核酸及理化特性与Ⅰ型相似。病毒可耐受氯仿、pH3，但对50℃加热敏感。

3 病原的变异性

1992年，Sandhu报道了Ⅰ型鸭肝炎病毒的变异株DHV-Ⅰa，并通过鸡胚交叉中和反应证实DHV-Ⅰa和典型的DHV-Ⅰ存在部分交叉反应[10]。Woolcock通过鸭胚肾细胞空斑减数试验证明这2个病毒有所不同[11]。在国内，林世棠[12]首先报道Ⅰ型DHV的变异株，其试验结果与Sandhu相符。随后，中国台湾Tseng[13]和韩国Kim[14]陆续分离出了与典型的DHV-Ⅰ基因组结构相近的DHV,称“台湾新型”和“韩国新型”,两种新型之间的血清学关系尚不清楚,但均不与DHV-Ⅰ产生交叉中和反应。2010年，何冉娅[5]对2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒进行流行病学调查及变异分析,结果表明华南地区DHV已发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。2011年，Liu[15]报道了中国第一例从鹅中分离到DHV-ⅠJT株病毒，可用抗DHV-Ⅰ的单克隆抗体检测阳性细胞和细胞质中的病毒抗原。用病毒序列特异性引物PCR扩增，完整的序列表明从鹅分离的JT株与韩国DHV-ⅠC AP-03337株显示了95.9%的同源性，而与经典的DHV-Ⅰ病毒仅为75.3%。80%雏鹅被JT株感染后均发展为出血性肝炎。张大丙主张将DHV分为血清Ⅰ型、“台湾新型”和“韩国新型”,分别对应基因A型、B型和C型,对于新的血清型统称为N-DHV[16]。为了进一步避免典型DHV-I及其变异株和DHV-II，III的混淆,引入了一个新的病毒种名,即将血清Ⅰ型、“台湾新型”和“韩国新型”归为鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)[17]。

2006年，KIM[18]对DHA-Ⅰ全基因组进行了测序，证明DHA-Ⅰ有小RNA病毒的基因组基本结构,即仅含一个大的ORF,其两侧分别是5'UTR和3'UTR，3'UTR之后是poly(A)尾。ORF编码一个聚蛋白,从N端到C端方向,分别为结构蛋白区(P1)和两个非结构蛋白区(P2和P3)。预测P1区裂解为3种衣壳蛋白 (VP0、VP3和VP1),P2区裂解为4种或5种非结构蛋白(2A1、2A2或2A2+2A3、2B和2C),P3区裂解为4种非结构蛋白(3A、3B、3C和3D)。Wang[19]对2001～2007年得到中国分离株血清Ⅰ型、“台湾新型”和“韩国新型”3种不同血清型的DHV的VP1、VP0、VP3蛋白全部核苷酸序列和3D蛋白的部分序列进行系统发育分析。发现基于VP1蛋白序列与基于其他3个蛋白序列的基因分群结果非常一致。因此，建议将3个基因群分为DHV A、B和C型。所有典型DHV-Ⅰ株称为基因型A，分离于“台湾新型”和“韩国新型”DHV株分别称为基因型B和C。Jin X[20]对分离于中国湖北省的DHV-ⅠJX高致病株进行序列分析，发现JX株与其他DHV-Ⅰ株有94%～99%的氨基酸水平95%～99%的核苷酸相似性。结果显示，核苷酸和氨基酸的突变主要分布在VP1基因的序列，暗示VP1很可能是DHV-Ⅰ毒力的主要决定因素。同年，Liu[21]对9个中国东南区的DHV分离株和3个DHV-Ⅰ弱毒疫苗株的VP1基因进行测序，发现分离株和所有疫苗株之间有2个氨基酸的一致替换；羧基末端区通常有最大的变量，在这里分离株和所有疫苗株之间发现6个一致差异，结果表明中国东南部分离鸭肝炎病毒Ⅰ型（DHV-Ⅰ）的VP1基因的遗传多样性与分离株制弱有关。王丽艳[22]扩增并测定15株DHV的衣壳蛋白编码区序列和部分3D序列。结果表明，在同一个基因型内，衣壳蛋白序列高度保守;在不同的基因型间，衣壳蛋白序列高度变异。但在3D氨基酸水平，型内序列高度保守，型间序列亦较为保守。并基于此，初步制定这样的基因分型标准:型内VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分别应大于或等于90%和92%、92%和96%、91%和95%，型间VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分别不超过72%和79%、73%和81%、74%和83%。部分3D核苷酸序列也可用于DHV的基因分型，型内相似性应大于或等于91%，型间相似性不超过82%。

4 鸭肝炎病毒检测方法

4.1 血清学诊断

血清学方法是目前检测DHV的主要方法，包括中和试验、间接血凝试验、SPA协同凝集试验、琼脂凝胶扩散试验(AGDP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体技术和空斑减少试验等。

4.1.1 中和试验

中和试验，分为鸭胚、鸡胚或病毒适应细胞中和试验。1950，Levine[23]首次报道该方法应用于DHVI的诊断。1969年，Hwang[24]改进待检血清和病毒反应的温度，研究表明DHV-I鸡胚中和试验准确、重复性好。1997年，陈琨[25]用鸭病毒性肝炎病毒及其阳性血清在鸭胚肝细胞单层上进行微量血清中和试验，结果表明，其敏感性高于鸭胚中和试验。目前中和试验仍然是公认的权威方法,但其操作繁琐、费时,不适于快速诊断，不能进行基层推广。

4.1.2 间接血凝试验

间接血凝试验，即以红细胞作可溶性抗原的载体来检测抗体。1996年，孙泉云等[26]粗提DHV经SephadexG200柱层析纯化后作为致敏用抗原，戊二醛法固定绵羊红细胞、BDB法致敏抗原红细胞，建立了检测DHV抗体的间接血凝试脸，然而由于非特异性凝血因子的影响，以及不同批次制备的红细胞在敏感性和稳定性方面有波动，限制了该方法的推广应用。

4.1.3 SPA 协同凝集试验

1996年，汪铭书等[27]应用葡萄球菌A蛋白作协同凝集试验，快速检测出了鸭肝炎病毒，对DHV攻击死亡的雏鸭肝脏的检出率为100%。结果表明SPA-CoA用于检测DHV的含毒材料，具有较好的敏感性和特异性，适用于临床及基层推广。

4.1.4 琼脂凝胶扩散试验(AGDP)

1961年，Murty等[28]首次报道采用琼脂凝胶扩散试验诊断DHV。1997年，许伟琦等[29]将2%PEG加入到琼扩试验中，能大大加快沉淀反应，而且提高了沉淀线清晰度。2002年，张济培等[30]用氯仿去脂和反透析法进行病毒的提纯浓缩,研究鸭肝炎的琼脂扩散试验。并发现琼脂凝胶配制的最佳方案是pH7.2,NaCl为80 g/L和琼脂糖的质量分数为1%。琼脂扩散试验易产生抗原不纯的现象,且检测灵敏度不高。

4.1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前常用的一种简便、快速、敏感的诊断检测方法之一。包括竞争ELISA法、间接ELISA法和双抗体夹心ELISA法等。1990年,赵新柳等[31]最先建立ELISA法检测鸭病毒性肝炎(DVH)抗体，并与琼脂免疫扩散试验(AGDP)进行了比较。结果表明ELISA的特异性与AGDP相一致;而在敏感性方面，ELISA的检出率为100%，而AGDP为60%。随着DHV单克隆抗体的研制成功，1992年，陈溥言等[32]建立了夹心ELISA检测方法，对蔗糖密度梯度离心和柱层析提纯病毒的检测，效果较好。1991年，范伟兴等[33]建立Dot-ELISA法，用抗DHV单克隆抗体检测DHV抗原，并获成功。除此之外，一些新兴的ELISA检测方法也相继报道[26,34-40]。ELISA法有简便、快速及特异性强等优点，但抗原纯度要求较高，阴性血清制备存在难度及单克隆抗体尚未商品化供应，推广受到一定限制。目前国内已有ELISA试剂盒申请专利。

4.1.6 荧光抗体技术

1972年，Maiborda[41]报道荧光抗体技术是检测接种雏鸭DHV最快速准确的诊断方法。1984年，郭玉璞等[42]运用该方法证实了北京地区流行的DHV由I型DHV引起。免疫荧光抗体法虽然具有快速、灵敏和准确等特点，但其费用较高，对设备的要求也很高，因此在基层推广应用该方法不太现实。

4.1.7 空斑减少试验

Woolcock等[43]首先建立了空斑减少试验检测DHV中和抗体，报道这一方法比鸡胚中和试验敏感。

4.2 分子生物学诊断

随着分子生物学技术的飞速发展，以及对DHV基因组研究的不断深入，分子生物学检测DHV有多种方法。主要包括RT-PCR方法、巢式RT-PCR和SYBR GreenI荧光定量RT-PCR方法等。

4.2.1 RT-PCR

2007年，马秀丽等[44]根据Genebank中I型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列,设计引物对DHV分离株采用RT-PCR，最低RNA模板检出量为100pg,成功建立DHV-I的RT-PCR方法，结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性。同年，程安春等[45]建立了检测DHV-I的RT-PCR方法，敏感性达到30 pg，且证明RT-PCR方法比病毒分离和Dot-ELISA具有更高的敏感性。罗玉均等[46]通过目前已发表的DHV-I基因组序列相对保守的区域，设计引物，成功建立了RT-PCR方法检测鸭肝炎病毒Ⅰ型。王非等[47]根据GeneBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列，设计引物对DHV-ⅠZJ-V株采用RT-PCR，结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性。2008年，高骏[48]、张祥斌[49]、刘艳萍[50]分别对 DHV-I分离株（S1、S2）、福建 DHV 分离株(DH1～DH6)以及河北、北京和天津 DHV 分离株(HB3、BJ5、TJ1)采用 RT-PCR，结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性。随后，2009年邵泽香[51]、党龙[52]、何冉娅[53]，2010 年魏雪涛[54]对RT-PCR条件优化，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT-PCR检测方法。

4.2.2 新型 RT-PCR 方法

2008年，黄显明[55]建立了适合DHV-I快速检测的RT-nested-PCR,第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。同年，罗玉均等[56]建立了巢式PCR与SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法，结果表明巢式PCR敏感性为6 pg/mL，实时荧光定量RT-PCR确定特异性产物的Tm值为85.6℃,最低能检测到含0.015 fg/μL阳性质粒标准品，显示了较好的特异性、敏感性。关育芳[57]、Yang M[58]先后成功地建立了一步法RT-PCR检测方法。该方法灵敏度高，且一步法的操作，既方便又减少污染的机会，具备了特异、快速和敏感的特点，更加适合于临床大量样品的检测。2011年，孙涛等[59]用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立I型鸭肝炎病毒的快速检测方法。PCR-DHPLC与荧光RT-PCR检测方法相比较,两种方法检测DHV-I的符合率为100%。李娇等[60]对DHV-I的逆转录巢式PCR检测方法进行优化，该方法第1次扩增的敏感性为100pg，第2次扩增的敏感性达到1pg，敏感性提高了100倍，表明该方法具有良好的敏感性，是一种有效的新方法。

4.2.3 RT-LAMP

反转录-环介导等温扩增 (RT-LAMP)是最早由Notomi等[61]报道的一种新型核酸扩增与检测方法。即采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件(60～65℃)下，不到1 h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到 109～1010个数量级[62]。2012 年，Song 等[63]建立了快速检测Ⅰ型鸭肝炎病毒的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测法，研究结果表明该方法与RT-PCR相比，具有更为快速、灵敏及可视化的优点。

5 结语

鸭病毒性肝炎的流行给养鸭业带来了巨大的经济损失。加快对鸭肝炎病毒的病原学、变异性、分子生物学和功能基因组研究进程，找出一种快速、灵敏及特异性的检测方法，对控制该病的传播和流行极为重要。目前，将基因工程技术运用到检测方法中,使DHV的检测更具特异性和敏感性,必将具有良好的应用前景。现在虽然市场上已有较好的DHV弱毒疫苗和灭活疫苗,但是从安全性、高效性等方面来考虑,利用高科技的基因工程技术,研发和推广基因工程疫苗将在DHV的防控起到至关重要的作用。

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