猪口服免疫F18ac+非产肠毒素大肠杆菌疫苗候选株后小肠免疫细胞的组织形态学特征

董立伟，张江英 （摘译）

（扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009）

1 材料和方法

1.1 细菌株 用于免疫的菌株为F18ac+非产肠毒素大肠杆菌疫苗候选株 2134（O157∶K119∶F18ac），攻毒使用 11-800/1/94 F4ac+ETEC 株（O149∶K91∶F4ac∶987P∶Hly+LT+STb+）。疫苗候选株通过特殊培养程序减毒。

1.2 单克隆抗体 详见表1。

表1 用于在免疫组织学上显示猪小肠内淋巴样和髓样细胞亚群的猪白细胞CD/SWC抗原特异性单抗

1.3 猪种及试验设计 试验所用猪只为15只杂交猪（瑞典长白×约克夏），未接种疫苗的对照组猪在第0d注射生理盐水，而试验猪连续 3 d（-2，-1，0）肌内注射2.5mg/kg免疫刺激剂量的左旋咪唑，或在连续3d（-2，-1，0）给予左旋咪唑的基础上，在第0d通过灌胃接种60mL于TSB内培养的1010CFU/mL F18ac＋非ETEC疫苗候选株2143。7d后，用1010CFU/mL的F4ac＋ETEC株11-800/1/94感染所有试验猪。第13d，在每组中选取3头猪施行安乐死，并进行免疫组织学取样。

1.4 从粪便中分离疫苗株及攻毒株 在注射左旋咪唑前2d开始以直肠拭子对每头猪在疫苗接种和攻毒后第0d、第7d和13d进行采样。

1.5 取样 每组猪中都观测到了腹泻现象（尽管强度、持续时间不同，且发生在每组不同编号的猪上），我们按照如下标准在每组挑选3头猪施行安乐死并取样：①腹泻的有无（＋或-）；②腹泻的程度（轻度为＋，中度为＋＋，＋＋＋为严重）。

1.6 免疫组化染色 施行安乐死后，其回肠和空肠的样本用生物素-抗生物素复合物（ABC）法进行染色。将鼠抗猪CD抗原特异性单抗（见表1）滴加在切片上并在室温下培养1h。二抗采用生物素化的兔抗鼠IgG。采用标准免疫组织学技术脱水并封片。

1.7 形态测定 利用数字图像分析（DIA）软件程序Lucia G定量计数空肠、回肠黏膜内淋巴样和髓样细胞亚群的免疫表型。利用t检验分析数据得出P＜0.05或更低，认为试验组和对照组的细胞数之间有显著差异。

2 结果

2.1 临床观测 试验期间，所有猪均没有显示大肠杆菌肠毒血症的临床症状，具体如表2所示。除了两头猪在第8d表现出中度的腹泻外，所有其他猪在接受攻毒后都没有产生腹泻症状。由于腹泻患猪是在第1d或第3d逐渐产生症状的，我们认为其不是由接种原因产生的，而推断为自然感染。

2.2 粪便样品中的疫苗株及攻毒株 如表3所示，在试验处理前后通过直肠拭子对分离的E.coli株及其数量进行评估。在试验的第13 d，从对照组及左旋咪唑＋F18ac＋非ETEC疫苗致敏组的仔猪中分离到了疫苗候选株（O157∶K119∶F18ac），菌落密度分别为1.0×106CFU/mL和8.0×105CFU/mL。从表3我们分析出，99.90%到99.92%的接种疫苗株（在第0d以1010CFU/mL浓度使用）不可能是特异性免疫后14d内增殖的。注射了左旋咪唑的仔猪粪便中并不能分离到这种菌株。然而在试验的第13d，我们却可以从这组中2/5的猪上分离出攻毒株（O149∶K91∶F4ac）。我们推测，由于类似的农场株（O8∶K87∶F4ac∶Hly）长期存在于这些猪的胃肠道中，会导致攻毒后菌株更能迅速地通过肠道，因而在其他两组猪上不能分离出攻毒株。在接种后第14 d和第7d可以分别在两组猪中分离出少量的疫苗株（0.08%～0.10%）及攻毒株（0.55%）。由此看来，攻毒株通过肠道的速率较疫苗株慢3倍。因此，较合适的免疫办法是对仔猪自断奶开始至少连续接种疫苗候选株3d，并在断奶时以较大剂量接种。

表2 基于粪便黏稠度评分的腹泻程度

表3 直肠拭子中分离出的E.coli株及其数量

2.3 免疫组化数据 本试验中我们已经证明了在肠绒毛上皮、肠固有层及回肠派伊尔氏小结中存在大量的CD3＋T细胞。我们还在淋巴滤泡中发现少量该细胞，它们均匀地分布在隐窝及绒毛区域。而幼稚的CD45RA＋淋巴样细胞在隐窝区域分布的数量则更为庞大。这些细胞在派伊尔氏小结中占优势的同时，在非淋巴滤泡区域内的数量也很大。CD45RC＋亚型多数位于绒毛固有层及淋巴滤泡间区，在派伊尔氏小结内很少发现。CD21＋B细胞在绒毛及派伊尔氏小结的淋巴滤泡内占据着数量上的优势。IgA＋浆细胞最常在隐窝区域内可见；具有种属特异性的SWC3＋巨噬细胞大多分布在上皮绒毛正下方的固有层中，但在隐窝之间也有发现。这些细胞很少分布在回肠的派伊尔氏小结内。

2.4 组织形态学数据 猪空肠和回肠中CD3＋、CD21＋、IgA＋及 SWC3＋淋巴样和髓样细胞的数量分别如表4和表5所示。定量的免疫表型分析显示，注射左旋咪唑的猪与未注射的猪相比，其空肠内CD3＋、CD45RC＋及 SWC3＋细胞有显著增加（P＜0.05）（见表 4）。而在这些猪的回肠中，仅有CD21＋细胞有显著增加（P＜0.01）（见表5）。接受左旋咪唑佐剂与试验疫苗联合注射的猪，所检测的小肠两部分的所有细胞在数量上都有大幅增加（见表4及表5）。

表4 定植于6周龄仔猪空肠黏膜上的淋巴细胞及髓细胞数量（平均数，×10-5）

表5 定植于6周龄仔猪回肠黏膜上的淋巴细胞及髓细胞数量（平均数，×10-5）

表4及表5中列出了仅免疫左旋咪唑的猪及用左旋咪唑＋F18ac＋non-ETEC疫苗候选株联合免疫的猪其回肠内淋巴样及髓样细胞亚群的形态学数据。结果用平均值及每1μm2组织切边视野内细胞数量的标准偏差表示；每个样本中的细胞由12个随机选取的视野（平均范围为 672387，5μm2）来计数。

3 讨论

由于遗传变异性大及其创造新毒力因子或掩盖表型特征的能力，某些肠道细菌往往可以逃脱宿主的肠道免疫。在断奶后一段时间内的应激也会导致仔猪患病。Bertschinger等（2000）曾描述过注射肠道类疫苗的同时饲以低能量日粮这个做法的有效性，研究显示，给断奶仔猪口服包含F18菌毛抗原的活疫苗对肠道大肠杆菌感染有很好的保护力。

猪对大肠杆菌造成的肠毒血症的抵抗力依赖于断奶时因刺激产生的主动黏膜免疫。目前的研究表明，含F18菌毛抗原的疫苗与左旋咪唑佐剂联用可以显著减少病菌的定植及感染产生的临床症状。近期的试验已经确证了该假说，即左旋咪唑对断奶仔猪肠系膜淋巴结（MLN）的淋巴细胞及巨噬细胞的免疫刺激效果有助于抵抗大肠杆菌病。BoæiÊ等（2003）认为，左旋咪唑使得MLN中参与细胞免疫的免疫细胞拥有更强的增殖能力和活性。Snoeck等（2006）报告，空肠的派伊尔氏小结是猪在接受F4菌毛肠道免疫后，黏膜免疫应答的主要诱导场所。

尽管口服活疫苗似乎较为有效，我们还是有必要对肠黏膜诱导和效应场所内的局部免疫反应做出评估。通过组织形态学分析，我们研究了产生F18ac菌毛抗原的非ETEC株口服免疫对断奶仔猪小肠黏膜淋巴样和髓样细胞定量及分布模式的影响。根据我们的结果，左旋咪唑的非特异性免疫刺激影响，以及它与F18ac＋非ETEC疫苗候选株的协同效应可能为断奶仔猪提供了有效的、对抗试验诱发的大肠杆菌肠毒血症的免疫保护。这些结果显示，与左旋咪唑联用的非ETEC疫苗候选株可以高度激发断奶仔猪回肠及空肠固有层和派伊尔氏小结内细胞的增殖，包括CD3＋T淋巴细胞，幼稚的CD45RA＋及记忆性CD45RC＋淋巴样细胞，CD21＋B 淋巴细胞，IgA＋浆细胞及 SWC3＋巨噬细胞。

4 结论

将本试验结果与其他对断奶仔猪口服免疫含F18菌毛抗原的活疫苗的研究结果进行对比，显示以左旋咪唑为佐剂的F18ac＋非ETEC疫苗对宿主可能有相加的免疫刺激效应。事实上，对于经左旋咪唑预处理及F18ac＋非ETEC疫苗候选株免疫的断奶仔猪，这种效应确实可以被所检测到的肠道免疫细胞亚群表达的增强所证实。这两种制剂可能在肠道免疫方面起协同作用，为断奶仔猪对于试验引起的ETEC感染提供更好的保护。我们的数据显示，通过对断奶仔猪进行双重免疫，使得非ETEC疫苗候选株的同源抗原可以针对性地激活主动黏膜免疫的诱发及效应位点，即回肠派伊尔氏小结和空肠或回肠固有层，从而获得对猪F4ac＋和（或）F18ac＋ETEC株感染的有效免疫保护。

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