微电子细胞传感器在抗肿瘤药物分析中的应用研究*

郑 波，刘清君，曾 苏

(1.浙江大学药学院药物分析与代谢研究室，浙江 杭州310058;2.浙江大学生物医学工程与仪器科学学院生物传感器国家专业实验室，浙江杭州310027)

0 引言

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率近年来一直都处于逐年上升的趋势。目前，化学药物治疗仍是肿瘤的重要治疗手段。因此，如何研发出能够有效抑制癌细胞生长增殖，或对其直接具有杀伤性作用的预防或治疗性药物是肿瘤防治的重要环节。随着医药技术的快速发展，体外培养的肿瘤细胞系为抗肿瘤药物的筛选与药效评价提供了一个有效的生物学方法。通过细胞的形态学观察与分子生物学实验能够以此获得药物对细胞的直接作用效果，并最终通过对培养细胞生长的抑制率差别，进行药物的筛选与评价。

近年来兴起了采用微纳米电子传感器芯片对细胞或组织进行直接测量的研究［1］。基于细胞电阻抗传感测试的ECIS(electrical cell-substrate impedance sensor)技术，便是一种能够同时测量多组不同细胞的电阻变化、膜电容变化，以及细胞层—基底膜空间变化的细胞生理与病理研究的细胞传感器(cell-based biosensor)技术［2，3］。通过 μA 级的电流测量，可以实时连续地量化研究细胞外基质与细胞增殖之间的相互作用，测量贴壁细胞迁移过程中细胞形态变化。相对于普通光学显微镜和荧光标记观察等传统方法而言，这种细胞传感器的阻抗测试使得细胞形态研究更为直观和方便，并容易获得实时定量的测试结果，从而已成为药物高通量筛选研究的有效平台［4，5］。

本研究在对细胞与电极界面阻抗检测理论分析的基础上，采用微纳米电子技术制备了以交错方式间隔排列的叉指电极阵列(interdigital electrode arrays)传感器芯片，搭建了阻抗测试分析系统，以人参皂苷Rh2等抗癌药物对人肺腺癌A549细胞模型的作用研究为例，建立了能对抗肿瘤药物进行实时、无损分析的细胞传感测试技术平台。

1 微电子传感器原理

将细胞培养在一个或多个电极上，有效的电极阻抗变化能够对培养细胞的黏附、伸展，以及迁移性进行无损检测。图1是阻抗细胞传感器的示意图，该系统可用于实时定量地检测贴壁培养的哺乳细胞的黏附和伸展生长过程。该技术最早由曾获得诺贝尔物理学奖的Giaever I和他的同事Keese C R在美国General Electric(GE)公司工作时发明［2，3］。他们采用哺乳动物细胞，用Au电极(2 cm2对电极和3×10－4cm2工作电极)表面进行了细胞培养。用一个带有函数发生器的锁相放大器和一个相位敏感探测器搭建测试电路，并用电阻限制电流约为1mA，在4kHz正弦波小信号下测量细胞与基底间的阻抗，即ECIS。采用交流阻抗方法使得金属微电极表面通过μA级的电流时，原来可以直接流经电极表面的电极电流，由于被培养生长在其表面的细胞所覆盖，而最终只能从细胞侧面通过电阻间隙区域流过。

ECIS系统的电极都是采用面积较小的微电极作为工作电极进行阻抗测量。小电极的缺点是细胞不容易分布在电极上，需要接种较大密度的细胞，以确保细胞能附着在电极表面，并且，小电极测量到的阻抗值只能反映一小部分细胞的状态，容易造成不同实验组别之间的差异。针对这些问题，基于叉指电极(interdigitated electrodes，IDEs)的细胞阻抗测量方法开始作为集成细胞培养系统，用于细胞动力学的检测。叉指电极能覆盖传感测试腔基底大部分的面积，因此，大大增加了有效测量细胞数目，产生有效阻抗。同时叉指电极也便于微型化，为其在药物或毒素的高通量应用奠定了基础［4，6］。

图1 细胞在电极界面的阻抗分析示意图Fig 1 Impedance analysis diagram on the electrode interface of cell

2 电极界面阻抗分析

电化学阻抗谱方法是一种常用的以小振幅的正弦波电位(或电流)为扰动信号的电化学测量方法，是一种频率域的测量方法，以测量得到的频率范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其他常规的电化学方法获得更多的动力学信息和电极界面的结构信息。因此，在微电极阻抗测试过程中，当对微电极施加电场时可以测量到一个基线阻抗，其主要是由电极和周边的离子环境决定。电极电解液界面的双电层结构相当于一个电容器，当电极电位改变时，双电层电容器即充电或放电。

当具有贴壁性能的肿瘤细胞贴附在电极之上时，测量电极间阻抗可提供关于电极上细胞活性状态的重要信息。当细胞生物状态发生变化时，系统可以实时并自动获取其模拟电信号，并最终转换成数字信号以进行进一步的分析［4］。如图1所示，测量所得的总阻抗包括了电极阻抗Ze，细胞与电极钝化层之间的溶液封接阻抗Rseal，以及细胞膜电容Cm1和细胞膜离子通道阻抗Rm1。其实，封接阻抗Rseal主要产生于电极上细胞膜所覆盖部分的电容和电导，所以，影响交流阻抗的最主要因素也就是封接阻抗Rseal，并且主要反映了细胞的生长状态与特性。

3 传感器芯片与系统

叉指电极阵列是由许多相互独立的叉指电极单元分别与两端的电极引线共同构成两对互相交错的叉指电极区域，相邻电极之间由绝缘材料相间隔［6］。电极芯片的加工，是在中国科学院上海微系统所，基于标准光刻技术的微加工工艺所完成。在硅基底溅射Cr薄膜约30 nm的基础上，磁控溅射约350 nm厚的Au膜作为电极材料。采用光刻、湿法腐蚀、等离子增强化学气相淀积等方法，最终获得叉指电极型生物电阻抗检测传感器芯片如图2所示。其各通道是12对直径为50μm的微电极，以交错的方式间隔50μm排列。最后，用环氧树脂将底部带孔的塑料培养腔黏贴在PCB板上，暴露出叉指电极阵列表面，作为细胞培养与测试的腔体结构，并最终配以相应的药物微进样与控制系统。

图2 细胞阻抗测量系统的叉指电极Fig 2 Interdigitated electrodes of the cell impedance measurement system

细胞检测时，传感芯片通过导线与放在细胞培养箱外面的Zanium电化学工作站(德国Zahner公司)相连，并与电脑通信以实现数据自动采集。通过施加到芯片电极上的交流激励，该电化学工作站能够在10μHz～4MHz频率范围内测量阻抗的幅值与相位变化，也能在固定频率下测量阻抗幅值和相位随时间的变化。进行阻抗测量时采用两电极体系，即分别与叉指电极两端连接的工作电极和连接在一起的对电极与参比电极。

4 药物抗肿瘤作用分析

在细胞实验中，将人肺腺癌细胞系A549细胞(浙江省中医院肿瘤科提供)，接种于芯片叉指电极表面进行传代培养。具体的细胞固定培养过程，严格按照细胞系常规无菌培养方法进行，并在显微镜下观察，细胞长满电极表面后进行药物分析测试实验。在整个过程中，芯片置于在5%CO2和37℃的培养箱环境中。

既往的抗肿瘤药物研究发现，天然药物人参的主要有效成分人参皂苷Rh2，对肺癌细胞的体内外生长具有显著的抑制作用。本研究中，选用人参皂苷Rh2作为代表性药物(浙江亚克药业有限公司提供的人参皂苷Rh2标准品)，在1 kHz固定频率下对3个独立通道的芯片阻抗进行同时监测，并用显微镜观察电极上细胞贴附和生长情况作为对照。图3是芯片在不同浓度药物(5，10，20μmol/L)刺激前后的阻抗变化，从中可以明显看出在加入药物后，阻抗大幅度地持续下降，尤其在药物加入50～150 min内下降最明显，一方面验证了测试系统的高效性，也得到了药物对细胞作用的时间依赖性结果。图4是通过显微镜观察的肺腺癌细胞在人参皂苷Rh2加入前后细胞的黏附情况和细胞形态。在药物作用前，可见大量圆形泡状肺腺癌细胞电极表面有贴附生长，细胞在电极表面有序排列，细胞与细胞间连接精密，细胞生产繁殖良好，视野可见大量细胞。在药物刺激以后，所见细胞数明显减少，所剩细胞几乎都从电极表面脱落，在电极间可见大量死亡细胞碎片和一些开始变型的细胞，这是细胞开始死亡的形态改变之一。

图3 抗肿瘤药物测试结果Fig 3 Test results of the anti-cancer drugs

图4 电极表面的细胞观察Fig 4 Cells observe on the electrodes

由于不同通道药物加入前的细胞的贴附情况不同，3个通道阻抗改变的程度也不同。比较3个通道的变化，通道1在200Ω左右趋于稳定，通道3到150Ω趋于稳定，说明试剂对细胞的作用有一定的浓度依赖性。对通道1阻抗曲线进行分析，在加入药物后阻抗就开始下降，在药物刺激的前几分钟，下降的速度较慢，在经过一段时间作用之后趋于稳定。推测这种阻抗改变规律与药物的作用机制有一定关系。结合已发表的人参皂苷Rh2对肺腺癌A549细胞作用机制的探究，人参皂苷Rh2可以诱导癌细胞凋亡，增加机体的免疫力，逆转肿瘤细胞的耐药性，当其与顺铂联用时，效果明显高于单独使用时对肺腺癌A549细胞的抑制率，并有一定的浓度依赖性。

随着信息技术与生物医药技术的不断结合，计算与系统生物学研究目标是通过运用计算生物学的方法，研究细胞、组织和生物整体不同水平上的各种分子及其相互作用。该研究同生物传感器技术，尤其是能够整体输出功能信息的细胞传感器技术结合，可以有效地揭示药物作用于癌细胞的作用机理。本文利用计算机辅助药物设计中的分子对接和药效团模型技术，对 Bcl—2，caspase—3，Fas，P53 等细胞凋亡相关蛋白与Rh2的细胞凋亡途径进行了研究［7］。如图5所示，是采用Surflex-dock系统进行分子对接后的Bcl-2蛋白的药效团模型构建结果。从生物计算的角度对传感器的结果进行了验证，并预示了将二者有效结合，用于抗肿瘤药物分析的可行性。同时，结合本次实验所得结果，其与用MTT比色法、流式细胞术，以及双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附剂测定)进行生物指标测定得到实验结果一致，而且其反应浓度更低。结果显示，细胞芯片阻抗测定的灵敏度更高，并具有良好的浓度依赖性和时间依赖性。

图5 细胞凋亡相关蛋白Bcl—2与Rh2的药效团分析结果Fig 5 Analysis results of the main target spot of the Rh2 to apoptosis-related proteins Bcl—2

5 结束语

从目前的细胞传感器技术来看，细胞微电子传感器平台能够为肿瘤细胞在不同药物干预下的作用提供一个便捷的检测技术手段，能够对固定培养于其表面的细胞的生理病理特性，如细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度，及其与细胞外基质分子的相互作用进行良好的评价。所有这些细胞特性的改变，都与肿瘤的发生发展极具密切关系。尤其是，如果进一步将肿瘤患者手术切除的癌组织标本收集分离得到的肿瘤细胞，经体外给药培养，通过传感器观察药物对细胞的直接杀伤作用，便可以根据化疗药物系列浓度对培养细胞生长的抑制率差别，最终建立起一套能在临床化疗前为患者筛选敏感性药物的检测技术。最终客观地针对不同个体，选择和优化化疗药物及其组合。

［1］王 平，刘清君.生物医学传感与检测［M］.杭州:浙江大学出版社，2010.

［2］Giaever I，Keese CR.Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field［C］∥Proc of Nat’l Acad Sci of USA，1984:3761－3764.

［3］Giaever I，Keese C R.A morphological biosensor for mammalian cells［J］.Nature，1993，366:591－592.

［4］Asphahani F，Zhang M.Cellular impedance biosensors for drug screening and toxin detection［J］.Analyst，2007，132:835－841.

［5］胡朝颖，刘清君，张远帆，等.基于叉指电极的细胞阻抗传感器研究［J］.传感技术学报，2010，23:291－296.

［6］Liu Q，Yu J，Xiao L，et al.，Impedance studies of bio-behavior and chemosensitivity of cancer cells by micro-electrode arrays［J］.Biosen Bioelectron，2009，24:1305－1310.

［7］Van M F，Huang D C S.How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis［J］.Cell Res，2006，16:203－213.