PPAR－γ在增生性瘢痕中的表达及意义

张义鹏 解学关 高伟阳 王安远 吕 雷 张国佑

活化的成纤维细胞被认为是瘢痕纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator－activated receptor gamma，PPAR－γ)是一类由配体激活的核转录因子，是核受体超家族成员之一［1］，具有多种生物学效应，对细胞生长、分化及凋亡具有重要影响，可作为负调节信号，参与多种组织和器官纤维化等多种病理生理效应，在纤维化发生和发展过程中发挥着重要作用［2］。目前PPAR－γ在皮肤纤维化形成机制中的研究报道很少。本实验拟研究PPAR－γ在增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的表达差异，探讨其在增生性瘢痕形成机制中的作用。

对象与方法

1．对象:增生性瘢痕组织分别来自笔者医院9例临床患者，其中男性4例，女性5例，患者年龄7～33岁，所有标本均取自于上臂、颈胸部及下肢近端，瘢痕生长时间4～14个月。正常皮肤组织分别来自上述患者瘢痕周围皮肤。所有患者无其他系统性疾病，瘢痕组织未经特殊处理。

2．方法:(1)常规原代组织块细胞培养:在超净工作台、无菌条件下，对组织块用PBS液冲洗5遍，移入培养皿中，用眼科组织弯剪剪弃脂肪和结缔组织，尽量去除皮下组织;用手术刀片切割成1～2mm宽的小皮条，放置于直径3．5cm的培养皿中，加入2．0U/ml的 DispaseⅡ(neutral protease，gradeⅡ)(Sigma公司)，4℃中冷消化，16～18h后，用显微镊分离表皮和真皮层;将获取的小皮条用眼科组织弯剪剪成1～2mm2的小组织，眼科镊均匀放入培养瓶中，加入3～5ml含20%胎牛血清(杭州四季青)的高糖－DMEM培养液(美国Gibco公司)，置37℃、含5%CO2的培养箱中培养，2～3天更换1次培养液。5～7天可见梭形的成纤维细胞游出，待细胞爬满瓶底，0．25%胰蛋白酶(含EDTA)消化传代。并取第3～5代的成纤维细胞进行实验。(2)实时定量聚合酶链式反应(real－time Q－PCR):以每孔1×106个细胞的密度将各组细胞分别接种于6孔板，培养3天后，利用RNA提取试剂盒 (美国 Invitrogen公司)提取正常成纤维细胞和增生性成纤维细胞总RNA，反转录(反转录试剂盒、美国 MBI公司)合成 cDNA模板，进行目的基因的 PCR扩增(PCR扩增仪、美国ABI公司)，产物倍比稀释，制备标准曲线样品。采用荧光定量RCP仪(美国Stratagene公司)分别扩增目的基因和内参基因，测定标准曲线和熔解曲线，用Ct值表示样品中模板的相对含量。荧光定量RCP的反应体系与条件:95℃预变性10min，1个循环，95℃、变性30s，退火40s，72℃延伸40s，共45个循环。每个样本的RNA含量均根据各自的β－2actin含量进行标准化。本实验所使用的正向引物(F)和反向引物(R):PPAR－γ(L)5'－ACTCCACATTACGAAGACATTCC －3';PPAR － γ，(R)5'－TTATCTCCACAGACACGACATTC －3'。(3)Western blotting法检测PPAR－γ蛋白表达水平:以每孔1×106个细胞的密度将各组细胞分别接种于 6孔板，培养3天后，每孔加入100μlRIPA细胞裂解液(碧云天公司)，4℃ 冰浴下提取总蛋白。以BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)进行蛋白定量 。每孔加入40μg蛋白进行10%SDSPA G E凝胶电泳，蛋白电泳转移仪将分离后的蛋白条带转至硝酸纤维膜上，封闭液室温封闭2h，按1∶800分别加入兔抗人PPAR－γ多克隆抗体(ABCAM公司)和兔抗人β－actin多克隆抗体(Santa cruz公司)，37℃孵育 2h，PBST洗膜 ，按1∶400加入羊抗兔二抗(Santa cruz公司)，37℃孵育2h，化学发光试剂反应2min，发光成像仪取像并测定条带灰度值。以目的条带与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

3．统计学方法:采用SPSS18．0统计软件进行配对样本t检验分析，取p＜0．05为有统计学意义。

结 果

1．实时定量聚合酶链式反应技术(real－time Q－PCR)检测正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中PPAR－γm RNA基因PCR扩增动力学曲线和PPAR－γ基因扩增产物的溶解曲线:结果显示PPAR－γ蛋白在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中均有表达，mRNA相对表达量根据2－ΔCT×100%计算。正常皮肤成纤维细胞中PPAR－γmRNA相对表达量为14．62% ±2．92%，增生性瘢痕成纤维细胞中PPAR－γmRNA的相对表达量为7．08% ±3．04%，增生性瘢痕组PPAR－γmRNA表达量明显低于正常皮肤成纤维细胞，差异有统计学意义(P ＜0．05，图1、图2)。

图1 PPAR－γ(m RNA)基因PCR扩增动力学曲线

图2 PPAR－γ基因扩增产物的溶解曲线

2．Western blotting法检测PPAR－γ蛋白表达水平:两组β－actin杂交条带亮度相似，于相对分子质量为50kDa位置均呈现PPAR－γ表达，但亮度有明显差异，正常皮肤PPAR－γ蛋白条带亮度明显高于增生性瘢痕PPAR－γ蛋白条带(图3)。正常成纤维细胞PPAR－γ蛋白的相对表达量为22．48% ±4.13%，增生性瘢痕组为9．40% ±2．23%。正常成纤维细胞PPAR－γ蛋白的相对表达量明显高于增生性瘢痕组，差异有统计学意义(p＜0．05)。

图3 增生性瘢痕及正常皮肤PPAR－γ蛋白条带

讨 论

瘢痕纤维化是在机体创伤修复过程中，由于全身和局部因素的影响，导致细胞外基质过度沉积和胶原降解减少而形成的最终结果［3］。活化的成纤维细胞被认为是瘢痕纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节，但增生性瘢痕确切形成机制目前尚不明确。

过氧化物酶体增殖物激活受体－γ(PPAR－γ)是一类由配体激活的核转录因子，是核受体超家族中的成员之一［1］。1990年Isseman等首次发现其存在于脂肪细胞的分化调控通路中，故又称为脂激活转录因子。PPAR－γ具有多种生物学效应，是体内糖、脂代谢的关键调节因子，对细胞生长、分化及凋亡具有重要影响，且与炎症、心血管疾病、糖尿病及肿瘤等多种疾病密切相关［4］。

研究发现:PPAR－γ参与多种组织和器官纤维化等多种病理生理效应，在纤维化发生和发展过程中发挥着重要作用，具有拮抗TGF－β1的促纤维化、调控TGF/Smad通路等效应［2，5］。高糖环境下培养的肾系膜细胞PPAR－γ表达降低、Ⅰ型胶原表达增加。以转化生长因子(transforming growth factor－β1，TGF－β1)作用于人肾小球系膜细胞，ECM成分明显增多。转染PPAR－γ载体或加入PPAR－γ激动剂匹格列酮干预后，Ⅰ型胶原表达水平降至正常水平，特异性抑制肾成纤维细胞增生和细胞外基质的合成，减轻了高糖及正常血糖状况下的进行性肾小管间质纤维化作用［6，7］。体内实验发现PPAR－γ激动剂同样能减轻肾小球硬化和肾间质纤维化的程度［8］。此外，在肝脏的星状细胞中有PPAR－γ的表达，活化的星状细胞中PPARγ的表达水平及转录能力均下降，天然或人工合成的PPAR－γ配体可抑制星状细胞增殖、Fb转分化和胶原过量合成［9，10］。在二甲基亚硝胺、四氯化碳和胆管阻塞所致的肝纤维化动物模型中，给予PPAR－γ的激动剂，可以减少细胞外基质的沉积和HSC的活化，抑制胶原和纤维连接蛋白的合成与分泌，减弱肝纤维化的发生、发展的程度［11］。PPAR－γ激活后，能抑制体外培养肝星状细胞受TGF－β刺激后Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的合成与分泌，抑制α－SMA的表达。实验证明PPAR－γ有可能逆转激活的增生性瘢痕成纤维细胞，并抑制Ⅰ型胶原酶启动子的活性、mRNA的表达以及胶原的过量表达［10］。PPAR－γ在肺纤维化的形成过程中，可能通过调节炎症反应，参与免疫反应，促进细胞凋亡，调节基膜增厚反应和细胞外基质沉积等途径来调节肺的纤维化。在大鼠肺纤维化模型中，发现 PPAR－γ激动剂具有体内抗肺纤维化的效应［12］。同时，体外细胞实验证实，将PPAR－γ激动剂作用于正常人和特发性间质性肺炎患者的肺成纤维细胞，发现有拮抗TGF－β1的作用，进而减少肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化及胶原的过度合成［13］。近来研究发现:采用不用浓度的PPAR－γ激动剂曲格列酮作用于体外培养的瘢痕疙瘩皮肤成纤维细胞，在一定浓度范围内TGF－β1、细胞外基质、Ⅰ型胶原及纤维连接蛋白在基因和蛋白水平均明显下调;同时能够明显抑制TGF－β1诱导的ECM的表达，且这种促进作用能够被PPAR－γ拮抗剂GW9662所抑制，其具体的作用机制可能与TGF/Smad通路有关。所有这些研究结果说明了PPAR－γ与体内各种器官的纤维化过程有着密切关系。

本实验应用具有高特异性和高灵敏性的实时定量PCR技术和Western blotting技术，分别从基因水平和蛋白水平检测PPAR－γ在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。结果提示PPAR－γmRNA和蛋白在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中均有表达，但在增生性瘢痕成纤维细胞中表达较正常皮肤成纤维细胞低。表明PPAR－γ可能在增生性瘢痕形成中发挥着重要的作用，参与了增生性瘢痕的形成过程。本实验为进一步研究瘢痕形成机制提供一定了实验基础，同时有望为瘢痕纤维化的临床治疗提供新的靶点。

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