Notch2、Notch4受体在哮喘小鼠肺中的表达及布地奈德、姜黄素对其影响

崇 蕾 张维溪 聂 颖 王 婷 李昌崇

Notch受体家族广泛存在于从无脊椎动物到哺乳动物等多种生物体内，参与多种组织细胞的信号识别、增殖、分化和凋亡等功能活动，近来研究表明，Notch参与外周T淋巴细胞及其亚群的分化发育过程［1，2］。支气管哮喘是一种由多种炎症细胞和细胞成分参与的慢性气道炎症性疾病，Th2细胞的分化发展是其发病的始动环节［3］。布地奈德作为一种吸入性糖皮质激素，具有减轻气道炎症和抗过敏的作用，但它的具体作用机制如何，目前尚未明确。Oh等［4］研究提示，姜黄素也可明显改善过敏性气道炎症和气道高反应性，故本研究利用布地奈德和姜黄素干预哮喘模型，观察其可能的作用靶点。

材料与方法

1．材料:体重18～22kg的SPF级雄性Balb/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司;卵白蛋白(OVA)和姜黄素药液购自美国Sigma公司;布地奈德雾化液由阿斯利康公司提供;SP二步法检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品;Notch2单克隆抗体和Notch4多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司;Trizol抽提试剂由美国Invitrogen公司提供;RT－PCR试剂盒购自美国Fermentas公司。

2．方法:(1)小鼠气道炎症模型的建立:将64只Balb/c小鼠适应性饲养3天后，随机分为4组，即正常对照组(A组)、哮喘组(B组)、布地奈德组(C组)和姜黄素组(D组)，每组8只。参照李昌崇等［5］方法制备哮喘小鼠气道炎症模型:分别于第1天和第13天经小鼠腹腔注射0．01%OVA/Al(OH)3混合液0．1ml致敏，第25～32天每天以1%OVA生理盐水溶液进行雾化激发;布地奈德组于每次OVA激发前2h雾化吸入0．5mg/ml的布地奈德雾化液，持续至最后1次激发［6］;姜黄素组小鼠于每次激发前20min胃饲姜黄素药液200mg/kg，持续至最后1次激发［7］;正常组以生理盐水代替OVA致敏和激发小鼠。(2)肺组织标本的采集及处理:各组小鼠于末次激发后24h内处死，取左肺肺门段组织固定于4%多聚甲醛，送病理科石蜡包埋切片，用于HE染色和免疫组织化学染色;取右肺组织迅速置于液氮冷冻后转入－80℃冰箱保存，用于RT－PCR检测。(3)肺组织中Notch2、Notch4受体蛋白的测定:用SP二步法检测试剂盒对肺组织切片进行Notch2(1∶400)、Notch4(1∶100)免疫组化染色，阳性结果为胞膜、胞质或胞核呈棕黄色，每张切片随机选择4个×400倍镜下支气管视野，图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度(MOD)，取其平均值作为该样本的MOD值。(4)肺组织中Notch2、Notch4受体mRNA的检测:用 Trizol一步法抽提总RNA，然后根据RT－RCT试剂盒说明进行反转录和PCR扩增。Notch2上游引物:5'－CAACTGTGAGGTGGACAAAAATG－3'，下游引物:5'－TGTTCATACACGGCTTGGAGATA －3';Notch4上游引物::5'－CACCAGGCTTGGAAGGGAG －3'，下游引物:5'－GAAACCAGGACGGCAGAGG－3';β－actin上游引物::5'－CGGGACCTGACAGACTACCTCAT－3'，下游引物:5'－CCACAGGATTCCATACCCAAGA－3'。以上引物均由上海基康生物工程有限公司合成。Notch2、Notch4、β－actin的扩增片段长度分别为398，353，272。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，用SMART凝胶图像分析系统进行条带扫描分析，以目的基因与内参照(β－actin)的IOD比值作为mRNA表达的相对含量。

3．统计学方法:用SPSS16．0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。用Levene'test进行方差齐性检验，同一指标各组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett'T3检验，以p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．各组小鼠HE染色结果:见图1。B组小鼠肺组织气管支气管周围炎细胞浸润明显，以中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为著，C、D组炎细胞浸润较B组稍减弱，而A组无炎细胞浸润。

2．各组小鼠Notch2蛋白和mRNA表达的比较:Notch2蛋白于A组主要表达在支气管上皮细胞的胞膜和胞质，于B组主要表达在支气管上皮细胞和淋巴细胞的胞核(淋巴细胞胞质少，胞核呈圆形，几乎占满了细胞，通过苏木素复染，胞核染成淡蓝色)，B组Notch2受体蛋白和mRNA水平明显高于A组(P均＜0．01)，C、D组Notch2受体蛋白和mRNA均低于B组(P ＜0．01)，但仍高于 A 组(P ＜0．01)(图1、图2、表1)。

图1 布地奈德、姜黄素对Notch2受体蛋白表达的影响(×400)

3．各组小鼠Notch4蛋白和mRNA表达的比较:Notch4蛋白主要表达于支气管上皮细胞和血管平滑肌细胞胞膜和胞质，4组Notch4受体蛋白和mRNA差异均没有统计学意义，P＞0．05(图3、表2)。

讨 论

图2 布地奈德、姜黄素对Notch2受体mRNA表达的影响

表1 各组小鼠肺组织中Notch2蛋白及mRNA表达的比较(n=8

表1 各组小鼠肺组织中Notch2蛋白及mRNA表达的比较(n=8

A～D分别为正常对照、哮喘、布地奈德、姜黄素组;与 A组比较，a p＜0．01，与B 组比较，b P ＜0．01

组别 蛋白mRNA A 0．049 ±0．004 0．041 ±0．007 B 0．104 ±0．005a 0．275 ±0．015a 0．075 ±0．002ab 0．088 ±0．012ab D 0．073 ±0．002ab 0．085 ±0．008 C ab

图3 布地奈德、姜黄素对Notch4受体mRNA表达的影响

表2 各组小鼠肺组织中Notch4蛋白及mRNA表达的比较(n=

表2 各组小鼠肺组织中Notch4蛋白及mRNA表达的比较(n=

A～D分别为正常对照、哮喘、布地奈德、姜黄素组;4组Notch4受体蛋白和mRNA差异均没有统计学意义，P＞0．05

组别 蛋白mRNA A 0．121 ±0．004 0．595 ±0．019 B 0．118 ±0．003 0．601 ±0．125 C 0．117 ±0．004 0．606 ±0．145 0．117 ±0．005 0．604 ±0．019 D

Notch家族是目前备受国内外学者关注的一类跨膜受体家族，在哺乳动物中发现有4种Notch受体和5种Notch配体。Notch广泛存在于多种生物体内，参与多种组织细胞的信号识别、增殖、分化和凋亡等功能活动，在多种细胞命运的决定中均发挥着重要作用［1］。越来越多的研究表明，Notch信号通路在调节外周T淋巴细胞分化过程中起了决定性作用，且不同的Notch受体和配体结合产生的效应可完全不同，这就使得Notch家族愈发神秘难解［2，8］。但大多数研究证实，在细菌、病毒、TLR配体等Th1诱导因素作用下，抗原呈递细胞(APC)表面DLL1或DLL4产生增多，与Notch3受体结合后可抑制Th2细胞分化，从而促进Th1细胞分化，而在蠕虫、过敏原、毒素或前列腺素E2等Th2诱导环境下，APC表面Jagged1/2配体增多，与 Notch1受体结合后诱导 Th2细胞分化［8］。而Notch2、Notch4对外周T淋巴细胞分化的作用不甚明确，且Kopan等［9］还发现Notch信号激活方式较一般的信号通路不同，激活后通过3次酶切作用，产生缩短的胞内段，及NICD，NICD随即进入细胞核，与靶基因结合产生一系列的生物学效应。故本研究通过免疫组化染色和RT－PCR观察Notch2和Notch4受体在Th2型免疫反应——哮喘中的表达情况，结果发现Notch2受体蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺组织中明显增高，且Notch2蛋白在哮喘组中主要表达于支气管上皮细胞和淋巴细胞的胞核，而Notch4受体蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺组织中的表达与正常组相比差异无统计学意义，说明Notch2受体在哮喘小鼠气道炎症中发挥了一定作用，且激活后大部分转移到了核内，Notch4则对哮喘小鼠气道炎症无明显影响。

布地奈德是一种吸入性糖皮质激素，较之全身性皮质激素，它局部浓度高，不良反应少，是目前控制和缓解哮喘发作的关键药物，但它的抗炎机制目前仍不十分明确，前期研究提示布地奈德可能部分通过Notch1受体发挥一定的抗炎作用，但它是否对Notch2受体也有类似的作用呢?姜黄素是从姜黄中提取出来的一种中成药，众多研究已证实，姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用，近期研究发现姜黄素可通过抑制NF－κB转录激活改善过敏性气道炎症和气道高反应性，那么它也可能通过Notch2受体对哮喘气道炎症有一定的作用［4］。

本实验利用布地奈德和姜黄素干预哮喘模型，发现布地奈德组和姜黄素组小鼠肺组织中Notch2受体蛋白和mRNA均比哮喘组减少，差异有统计学意义，而两组小鼠肺组织中Notch4蛋白和mRNA表达与哮喘组相比，差异无统计学意义，提示布地奈德和姜黄素均可部分通过抑制Notch2信号改善哮喘气道炎症［10］。

综上所述，Notch2信号在哮喘气道炎症过程中也发挥了一定作用，布地奈德和姜黄素可能部分通过抑制Notch2信号改善哮喘气道炎症，而Notch4对哮喘气道炎症的发生发展影响不大。近年来，哮喘的定义在不断的改进改善，哮喘的治疗方案也在不断的演变完善，寻求更有效、不良反应更少的治疗方案是当前医务工作者的首要任务，深入研究药物的作用靶点可为以后的联合用药提供更精准的理论依据，为进一步完善哮喘的治疗方案打下基础。

1 Gazave E，Lapebie P，Richards GS，et al．Origin and evolution of the Notch signalling pathway:an overview from eukaryotic genomes［J］．BMC Evol Biol，2009，9(1):249 －276

2 Osborne BA，Minter LM．Notch signalling during peripheral T － cell activation and differentiation［J］．Nature，2007，7(1):64 －75

3 Peter J．Barnes．Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］．Nat Rev Immunol，2008，8(3):183 －192

4 Oh SW，Cha JY，Jung JE，et al．Curcumin attenuates allergic airway inflammation and hyper－responsiveness in mice through NF－kappaB inhibition［J］．J Ethnopharmacol，2011，136(3):414 － 421

5 李昌崇，张维溪，陈小芳，等．巨噬细胞炎性蛋白1α及其mRNA在哮喘小鼠气道炎症中的作用［J］．中华儿科杂志，2004，42(2):90－93

6 沈华浩，王绍斌．布地奈德干预对卵白蛋白致敏小鼠抗原激发后气道炎症及气道重塑的影响［J］．中华结核和呼吸杂志，2005，28(3):13－18

7 孙杰，吴斌，梁标，等．姜黄素对哮喘小鼠α－SMA的表达及气道重构的影响［J］．第四军医大学学报，2009，30(7):603－605

8 Amsen D，Antov A，Flavell RA．The different faces of Notch in T －helper－ cell differentiation［J］．Nature，2009，9(2):116 －124

9 Kopan R，Ilagan MX．The Canonical Notch Signaling Pathway:Unfolding the Activation Mechanism［J］．Cell，2009，137(2):216 －233

10 Sohei M，Hironori S．Evolution of asthma concept and effect of current asthma management guidelines［J］．Allergy Asthma Immunol Res，2010，2(3):172 －176