三叶青提取物联合介入治疗兔VX2肝癌模型多层螺旋CT表现及肝功能动态分析

贾玉柱 劳 群 祁克信 陆海华 杨光钊 魏克民

肝癌的早期治疗仍首选手术切除，但对中晚期 常伴有较严重肝硬化的肝癌病例，综合治疗已成为共识［1］。利用中药联合介入技术治疗中晚期肝癌的综合治疗，是近年来研究的新热点［2］。

三叶青为葡萄科崖爬藤属植物，学名为三叶崖爬藤，生于阴湿山坡、山沟中，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，主要用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎、肿瘤等［3］。本研究采用三叶青提取物灌胃及碘油+化疗药物肝动脉灌注对兔VX2肝癌模型的抑瘤作用做动态影像学实验研究，通过对肿瘤大小、生长率、坏死率以及CT值强化程度的动态影像学观察，以及GPT、GOT等肝功能方面的研究，以病理为最终验证，为临床三叶青抗肿瘤研究提供动态的影像学实验资料，为中药结合肝动脉碘油化疗药物栓塞术(transluminal arterial cheminal embolization，TACE)方法综合治疗肝肿瘤提供实验依据。

材料与方法

1．实验动物:健康新西兰大白兔33只，雌雄不限，体重2.0～2．5kg，由浙江省实验动物中心，生产许可证:SCXK(Z)2009－0039。

2．VX2瘤株制备与瘤兔接种:(1)VX2瘤株制备:VX2瘤株由温州医学院动物实验中心惠赠。实验兔采用1%戊巴比妥钠溶液(1ml/kg)经耳缘静脉注射麻醉后，仰卧固定自制手术台上，消毒铺巾后，切取瘤块边缘旺盛的鱼肉样VX2肿瘤组织，放置与预先配置好的生理盐水中(50ml生理盐水+80mg庆大霉素)，去除坏死组织和结缔组织后，用眼科剪剪成约1mm×1mm×1mm小块瘤株。用1ml针筒抽取制备好瘤细胞液体1ml，连接3F穿刺针，将VX2鳞癌瘤株接种兔腹股沟区皮下或肌内使之成瘤并以之传代。余下瘤细胞用生理盐水配制成VX2瘤组织混悬液约1×106个/毫升。(2)兔VX2移植瘤的种植:将麻醉固定好的实验兔，备皮左上胸腹部，CT定位下选取肝脏最大层面做腹部皮肤标记，聚维酮碘消毒3次，消毒约直径10cm范围，铺无菌巾，切开腹腔将兔肝左中央叶充分暴露，挑开肝包膜将悬液用16号针头注入肝实质内接种。术后给予庆大霉素8万U肌内注射，连续3天抗感染。接种2周后备用。(3)药品:三叶青原料，华东医药公司中药分公司提供(鉴定为Tetrastigma hemsleyanum Diels et．Gilg)，粉碎过100目筛。(4)三叶青提取物制备:将10kg三叶青分别加乙醇80L提取3次，每次2h，合并提取液，回收溶剂，得浓缩液。浓缩液用2倍量乙酸乙酯萃取3次后合并溶剂，挥干溶剂，冷冻干燥，得到三叶青乙酸乙酯提取物。

3．实验方法:瘤兔随机分为 A、B、C 3组，A组:三叶青联合介入治疗组;B组:单纯介入治疗组;C组:对照组，每组11只，雌雄不限，肝癌模型种植后A组瘤兔于造模后术后8天开始用三叶青提取物灌胃，2周后联合介入治疗;B组瘤兔2周后单纯介入治疗;C组2周后动脉灌注生理盐水。瘤兔接种瘤株14天后，A、B、C 3组荷瘤兔用1%戊巴比妥钠1ml/kg体重全麻后，固定于手术台上，常规准备。根据腹股沟区血管走向纵行切开皮肤，分离开的股动脉3cm置入导丝，退出穿刺针后引入4F导管，于T11间隙主动脉处注入对比剂，寻找腹腔干开口，了解肝血管走行，3F同轴微导管在微导丝导向下，送达肝总动脉处，手推造影显示肿瘤血供情况，进行肿瘤供血动脉的超选，造影证实肿瘤染色后按分组要求注入药物:1mg/kg阿霉素与0．2mg/kg超液态碘油。术后拔出导管，加压包扎切口，术后肌内注射青霉素抗感染3天。C组仅动脉灌注生理盐水。

4．观察指标及方法:兔VX2肝癌模型肝CT扫描前的实验室检查:GPT、GOT肝功能指标。肝CT扫描:采用1%戊巴比妥钠麻醉后，运用GE16排螺旋CT机，120kV，200mA，层厚3mm，Pitch1．5mm，FOV480mm，后处理重建 1．5mm，造影剂采用碘海醇4ml，经耳缘静脉快速推注，立即作CT增强扫描。调整窗宽窗位，测量肿瘤大小、单位面积平扫及增强平均CT值，注意尽可能同层同部位测量，测量3次，取平均值，以确保对比数据的可靠性和准确性。治疗后14天CT扫描后记录肿瘤大小，肿瘤体积大小按照V=1/2ab2(a为最大径，b为最小径)，计算肿瘤生长率，肿瘤生长率(growth rate，GR)=V治疗后/V治疗前×100%;14天后处死兔子，10%的甲醛固定，石蜡包埋切片，每份标本在肿瘤最大层面做病理切片，光镜观察并用图像采集系统采集图像。结合光镜观察和采集图像的测量，计算出肿瘤坏死区域和整个肿瘤的面积，二者之比即为肿瘤组织坏死率;组织病理学表现，包括大体变化，转移情况，HE染色观察肿瘤以及周边正常肝组织的变化。

结 果

标本切面见C组色泽灰红、鲜嫩鱼肉状外观，中心少量液化坏死;B组边缘色泽暗红、如老化鱼肉状外观，中心液化坏死较C组较重;A组质地明显软化，中央大片灰黄色凝固坏死，凝固坏死区并有液化坏死腔及“瘀泥”样坏死物。肿瘤坏死率:A组(67．23±7．26)%;B 组(52．35 ± 6．27)%;C 组(42．67 ±7.38)%。结果示单纯介入治疗，介入治疗联合三叶青提取物治疗，不予治疗均可引起肿瘤坏死，坏死率3组间比较均有显著性差异(p＜0．01)，介入治疗联合三叶青提取物治疗肿瘤坏死率最高(表1)。A组与B组荷瘤兔肿瘤体积及CT值变化有统计学差异(p＜0．05)(表1、表2)，治疗后A组血清GTP、GOP较B组低，与B组相比有统计学意义(p＜0．05)(表3)。

表1 3组治疗前后VX2兔肿瘤体积变化及生长量(n=11

表1 3组治疗前后VX2兔肿瘤体积变化及生长量(n=11

治疗前后VX2兔肿瘤体积比较，*p＜0．05;肿瘤生长率A、B、C组间比较，※P ＜0．05，肿瘤坏死率 A、B、C 组间比较，ΔP ＜0．05

组别 治疗前体积(cm3)治疗后两周体积(cm3)生长率(%)坏死率(%)A 组 1．35 ±0．22 2．23 ±0．26* 165．2 ±17．45※ 67．23 ±7．26Δ B 组 1．32 ±0．28 3．48 ±0．24* 263．6 ±15．23※ 52．35 ±6．27Δ C 组 1．37 ±0．21 4．75 ±0．32* 346．7 ±16．42※ 42．67 ±7．38Δ

表2 3组VX2兔肿瘤平均CT值变化(HU)

表3 3组治疗前后血清GPT、GOT量表(IU/L)(n=11

表3 3组治疗前后血清GPT、GOT量表(IU/L)(n=11

治疗后血清 GPT、GOT 量 A、B、C 组间比较，*P ＜0．05

组别GPT GOT术前 术后2周 术前 术后2周A 组 40．65 ±5．78 56．48 ±7．84* 35．94 ±7．41 44．31 ±6．23*B 组 38．87 ±6．54 80．45 ±6．74* 37．26 ±3．48 60．74 ±7．54*C 组 40．45 ±5．64 120．26 ±8．84* 36．81 ±36．91 135．28 ±6．53*

讨 论

恶性肿瘤目前在医学界尚无理想的药物和方法，肝癌是常见的恶性肿瘤，手术切除被公认为肝癌根治的首选方法，但至今手术切除率仍不足30%，在手术切除的患者中，有30% ～70%出现肝癌复发和转移［4］。目前TACE已经成为肝癌治疗行之有效的方法［5］。但目前使用的化疗药，主要作用机制是阻止脱氧核糖核酸、核糖核酸或蛋白质的合成，或者直接对这些高分子发生作用，这些药物毒性大，对机体免疫力、肝肾功能等都有不同程度的损伤，尤其不适合应用于肝硬化合并肝癌的治疗，而且，化疗药对肿瘤细胞耐药性日益增加，加重了病人和国家的经济负担［6］。

近些年来，用于对VX2兔肝癌生长情况检测的方法有B超、CT、MRI、DSA等，这4种方法都有一定的优缺点［7］。本研究结果表明，CT检查方便、简单，直观性好，可重复性强，可直观准确地观察移植瘤生长情况。本模型生物学行为与人类的原发性肝癌相同或相近，可以模拟人类肝细胞肝癌，CT表现类似于人类肝细胞性肝癌“快进快出”的强化特点。种植后2周平扫肿瘤与周围肝脏实质分界清楚，呈低密度或等密度，增强扫描动脉期强化明显(CT值增加35HU左右)，与病理上所见癌细胞巢内富含多量薄壁血管相一致;多数可见增粗的供血动脉直达肿瘤边缘并向瘤组织内延伸，周围正常肝脏实质期强化明显(CT值增加40HU左右)，与以往报道类似。如果肿瘤较大超过2．5cm以上，中心可出现液化坏死，表现为环状强化特征，后经病理证实与以往报道相似。

研究表明，三叶青乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞具有很好的细胞毒作用，对正常原代大鼠细胞毒性较小，三叶青急性毒性试验和长期毒性试验证实，三叶青高剂量组为人体推荐剂量的120倍，试验证实安全无毒;对小鼠TNF－α、IFN－γ具有上调作用，具有增强小鼠的细胞免疫和体液免疫功能［8］。本实验3组螺旋CT显示三叶青提取物组对VX2瘤兔的治疗前后VX2兔肿瘤体积增长减小，生长率减低，坏死率增高，平均CT值变化较其他两组均有差异，对VX2瘤兔血清肝功能有效的改进，病理组织学显示三叶青治疗组坏死率高，且为凝固性坏死多见，周围肿瘤组织软化明显较其他组鱼肉状外观有所不同。本研究发现三叶青提取物不但在肿瘤进展方面可以做到有效的控制，而对于VX2瘤兔有良好护肝保肝的作用，三叶青提取物有其独特的保肝护肝作用，与介入疗法的联合应用，兼顾了整体与局部、宿主与癌肿、症状与疾病等方面，取长补短，使治疗方案更加全面合理，真正起到了遏制肿瘤生长及减毒增效的作用。

1 中华医学会中华放射学杂志编委会介入放射学组．肝癌介入治疗规范化条例(草案)［J］．中华放射学杂志，2001，35(12):888

2 李淼，李铭．肝癌中药介入治疗的应用基础与临床研究现状［J］．北京中医药，2009，28(2):146 －147

3 何福根．三叶青抗肿瘤作用及其机制研究进展［J］．肿瘤学杂志，2010，6(1):75 －77

4 Cross D，Burmester JK．Gene therapy for cancer treatment:past，present and future［J］．Clin Med Res，2006，4:218 － 227

5 肖运平，肖恩华．介入治疗在防治肝癌术后复发中的作用及进展［J］．介入放射学杂志，2008，17(11):831 －834

6 姜宪辉，叶华．原发性肝癌127例介入治疗的临床研究［J］．临床医学工程杂志，2008，15(10):19 －20

7 韩志刚，程红岩，胡海洋，等．兔VX2肝癌模型的制作及CT，MRI表现［J］．中国介入影像与治疗学，2007，4(1):61－65

8 汪珍，冯健，王晓华，等．三叶青提取物对人结肠癌细胞系RKO细胞凋亡的影响［J］．浙江中医药大学学报，2008，32(3):321－322，324