温度对加曲速酿低盐鱼露性质的影响

翁武银，陈书霖，刘光明，苏文金，曹敏杰

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

鱼露是我国沿海地区及东南亚地区自古以来利用鱼贝类制造的水产发酵调味品。传统鱼露的生产工艺是在低值鱼中添加30%以上的食盐，通过腌渍和日晒夜露进行天然发酵［1］，高浓度的盐虽然可以防止鱼体在发酵过程中腐败变质、抑制细菌的生长繁殖，但同时也严重抑制了鱼肉内源性蛋白酶的活力，导致鱼肉自溶和蛋白分解速度下降，大大延长了发酵周期［2］。此外，传统鱼露还具有一定的腥臭味，限制了鱼露产品在内陆市场的推广。因此，随着人们消费水平的提高以及饮食习惯的改变，具有良好风味的低盐鱼露已成为社会发展的主流方向。为了缩短鱼露发酵周期，近年来研究报道的快速发酵方法主要有超高压水解法［3］、外加蛋白酶［4］和富含蛋白酶的内脏发酵［5］、外加曲发酵［6］，以及加酸减盐发酵［7］等。其中，外加曲发酵鱼露是在天然发酵的基础上通过添加酱油曲，利用曲种繁殖时分泌的各种蛋白酶分解鱼肉。该工艺不仅可以缩短鱼露发酵周期，还能改善鱼露的风味，相对其它快速发酵方法，将具有更好的应用前景。然而，外加曲发酵的低盐鱼露与低盐酱油类似［8］，在发酵过程中酱醅表面有时会发生霉变出现菌膜，使鱼露品质下降。据报道，发酵温度直接影响酱醅中微生物的种类、数量和酶的活力，甚至也会影响鱼露产品的风味和滋味［9］。然而，有关温度对加曲速酿低盐鱼露的影响尚未见报道。本研究以低值海洋鱼类蓝圆鲹为原料，通过添加酱油曲，考察在发酵过程中发酵温度对低盐鱼露理化性质的影响，以期为鱼露的加曲速酿工艺投入实际生产提供更多的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻蓝圆鲹 福建厦门集美农贸市场，鱼体平均重量为100g左右，平均体长为25cm左右;酱油曲(Aspergillus oryzae) 日本酿造工业株式会社;浓硫酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司;硫酸铜上海久億化学试剂有限公司;甲醛、邻苯二甲酸氢钾 广东西陇化工厂;硼酸、无水碳酸钾 上海试剂总厂;硝酸银 上海申博化工有限公司。

Avanti JA－25高速冷冻离心机 美国Beckman公司;WB－10L1恒温水浴锅 德国Memmert公司;PSX智能型恒温箱 宁波莱福科技有限公司;877型自动电位滴定仪 瑞士万通中国有限公司;L－8900氨基酸自动分析仪 日本Hitachi High－Technologies公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵 将半解冻状态的整条蓝圆鲹利用搅碎机绞碎，绞碎的蓝圆鲹与酱油曲、盐、水按1∶0.1∶0.225∶0.5的质量比混合，搅拌均匀制成酱醅，分别放置于20、30、40℃恒温箱中恒温发酵90d，期间定期取样进行分析检测。

此外，将酱醅放置于20℃恒温箱中保温发酵30d后，再利用30℃保温发酵60d，记为20－30℃分段保温发酵;而20－30－40℃保温发酵是将酱醅放置于20℃下保温发酵30d后，依次在30、40℃下各继续发酵30d。

1.2.2 鱼露样品的制备 舀取一定质量的发酵酱醅，利用高速冷冻离心机离心(10000×g，4℃)30min，将获得的上清于85℃下水浴15min，用碎冰迅速冷却后，再离心(10000×g，4℃)15min去掉不溶性物质，制备成鱼露样品。

1.2.3 鱼露理化指标测定 酱醅pH的测定:采用pH计直接测定。

可溶性总氮(TS－N)的测定:采用凯氏定氮法测定［10］。

氨基酸态氮(AA－N):用自动电位滴定仪，甲醛滴定法测定［10］。

挥发性盐基氮(TVB－N):采用康维皿法(微量扩散法)测定［11］。

游离氨基酸分析:经滤纸过滤后的鱼露用蒸馏水稀释500倍后，利用氨基酸自动分析仪测定鱼露中的游离氨基酸含量。

感官评价:在Fukami等［12］感官评价方法基础上有所改动:取10mL鱼露在室温下静置30min，用商品鱼露作为对照，感官评价小组由10人组成(5男5女，年龄在20～35岁)，在感官评价前，先多次进行风味描述的一致认定和培训，然后对鱼露的气味(鱼腥味、酱香味、肉香味、胺味)和滋味(苦味、酸味、鲜味)进行感官评价，满分为10分，具体标准如表1所示。

1.2.4 数据统计与分析 所有数据采用SPSS16.0软件(SPSS Inc，Chicogo，IL，USA)分析，用 ANOVA 进行方差分析，显著性检验方法为邓肯多重检验，检测限为0.05［13］。有关数据为3次以上平均值。

表1 感官评价标准Table 1 Standards of sensory evaluation

2 结果与分析

2.1 恒温发酵对加曲发酵鱼露性质的影响

2.1.1 酱醅的pH 图1显示了不同温度下鱼露酱醅pH的变化。由图可见，酱醅pH都呈现出先下降后上升的趋势，提高发酵温度，前期的pH下降速度明显加快，这可能是提高温度促进了乳酸菌发酵产酸的缘故。20℃和40℃保温发酵在发酵60d后，酱醅pH都逐渐趋于稳定，而且在20℃保温发酵的pH最低;30℃保温发酵的酱醅pH在60d后出现上升的趋势，经过90d发酵后其pH逐渐接近6.0。pH是鱼露发酵过程中各种反应的综合表现。通常，伴随着发酵的进行，鱼肉中有机酸类物质的溶出以及蛋白质水解为游离氨基酸等会使酱醅pH下降，而在腐败微生物的作用下，含氮化合物等分解产生组胺、三甲胺等碱性物质将使酱醅pH上升［14］。甚至有研究指出，当腐败菌生长旺盛时，酱醅pH就会迅速上升并超过6［15］。因此，图1的结果表明加曲速酿鱼露的发酵不适合在30℃下进行。

图1 不同发酵温度下鱼露酱醅pH的变化Fig.1 The pH changes of fish sauce mash during fermentation with different temperature

2.1.2 氨基酸态氮(AA－N) 氨基酸是鱼露的主要呈味物质，也是用来判定鱼露发酵程度的特性指标［16］。因此，对发酵过程中鱼露的氨基酸态氮(AA－N)含量变化进行了测定，结果如表2所示。从表中可以看出，不管在任何发酵温度下，伴随着发酵时间的延长，鱼露中AA－N含量均出现逐渐增加的趋势，经过70d发酵后开始出现稳定;20℃下发酵的鱼露AA－N含量最低，30℃和40℃发酵获得的鱼露AA－N含量基本相同。鱼露中的氨基酸主要是鱼肉蛋白在各种蛋白酶和微生物作用下分解产生的，而蛋白酶和微生物的活性主要受到pH和温度的影响，发酵温度太低时有些蛋白酶和微生物的活性也较低，然而过高的发酵温度可能使有些蛋白酶或微生物失去活性。因此，表2的结果表明适当提高发酵温度可以促进蛋白质分解成氨基酸。

表2 发酵温度对鱼露氨基酸态氮含量(AA－N，g/100mL)的影响Table 2 Effect of fermentation temperature on the amino－acid nitrogen content(AA－N，g/100mL)of fish sauces

2.1.3 可溶性总氮(TS－N) 可溶性总氮(TS－N)含量是鱼露质量分级的重要指标之一，是鱼露中游离氨基酸态氮、小分子肽氮、可溶性蛋白氮等物质的综合反映［17］。在发酵过程中温度对鱼露中TS－N含量的影响如表3所示。由表可知，不管是低温发酵还是高温发酵，发酵70d以后鱼露中的TS－N含量基本趋于稳定。而且，发酵温度越高，鱼露中TS－N含量也越多，进一步表明了提高发酵温度有利于鱼肉蛋白的分解和可溶性蛋白的溶出。

根据以上的分析结果，发现20℃低温发酵虽然可以使酱醅pH保持稳定，然而鱼露中的AA－N和TS－N含量都比较低。另一方面，提高发酵温度虽然可以提高鱼露中的AA－N和TS－N含量，然而也可能会促进酱醅中腐败微生物的生长繁殖，导致酱醅pH上升。因此，采用先低温后高温分段保温发酵方式进一步探讨温度对加曲速酿鱼露性质的影响。

表3 发酵温度对鱼露可溶性总氮含量(TS－N，g/100mL)的影响Table 3 Effect of fermentation temperature on the total soluble nitrogen content(TS－N，g/100mL)of fish sauces

2.2 分段保温发酵对鱼露性质的影响

2.2.1 酱醅的pH 图2显示了先低温后高温分段保温发酵对酱醅pH的影响。从图中可以看出，将20℃发酵30d的酱醅移到30℃下继续发酵60d(20～30℃)，发酵后期pH虽然也出现缓慢上升趋势，但与单一的30℃恒温发酵相比(图1)，酱醅pH的上升的速度明显得到抑制。另一方面，对20℃发酵30d，接着30℃发酵30d，最后40℃发酵30d(20－30－40℃)的酱醅pH进行分析，结果发现pH在发酵过程中没有出现上升的趋势。通常，低温发酵有助于抑制腐败菌的生长繁殖，同时鱼肉蛋白分解生成游离氨基酸，促使酱醅呈现酸性，也会抑制腐败微生物的作用。因此，先低温后高温分段保温发酵工艺可以抑制加曲速酿低盐鱼露在发酵过程中pH的上升，达到抑制腐败菌生长繁殖的作用。

图2 分段发酵下鱼露酱醅pH的变化Fig.2 The pH changes of fish sauce mash during subsection fermentation

2.2.2 氨基酸态氮(AA－N) 表4显示了分段保温发酵对鱼露AA－N含量的影响。将20℃发酵30d的酱醅移到30℃下进行发酵时，鱼露中的AA－N含量出现明显的增加，而且在30℃下继续发酵40d后，发酵总天数达到70d时，AA－N含量逐渐稳定在1.29g/100mL，但略低于 30℃恒温发酵的 1.36g/100mL(表2)。这可能是30℃恒温发酵时腐败微生物繁殖旺盛，鱼露中铵盐含量增加，结果导致利用甲醛滴定法测定的氨基酸态氮数据偏高［18］。另一方面，当利用20－30－40℃分段保温发酵制备鱼露时，发酵90d的鱼露AA－N含量与40℃恒温发酵(1.35g/100mL)基本一致，表明通过分段保温发酵不会影响鱼露产品的AA－N含量。

表4 分段发酵对鱼露氨基酸态氮含量(AA－N，g/100mL)的影响Table 4 Effect of subsection fermentation process on amino－acid nitrogen content(AA－N，g/100mL)of fish sauces

2.2.3 可溶性总氮(TS－N) 表5显示了在发酵过程中不同分段发酵对鱼露TS－N含量变化的影响。与AA－N含量变化趋势类似(表4)，在改变发酵温度后，鱼露TS－N含量都出现明显的增加，20－30－40℃发酵下的鱼露可以获得高含量的TS－N，进一步表明了采用逐渐升温的分段发酵方式可以有效实现鱼肉蛋白的分解以及可溶性蛋白的溶出，缩短鱼露发酵时间。

表6 鱼露中挥发性盐基氮含量(TVB－N)Table 6 The total volatile basic nitrogen(TVB－N)of fish sauces

表5 分段发酵对鱼露可溶性总氮含量(TS－N，g/100mL)的影响Table 5 Effect of subsection fermentation process on total soluble nitrogen content(TS－N，g/100mL)of fish sauces

2.3 鱼露品质的分析

2.3.1 挥发性盐基氮(TVB－N) 为了进一步了解发酵温度和发酵方式对鱼露品质的影响，对发酵90d的鱼露产品的挥发性盐基氮(TVB－N)进行了测定，结果如表6所示。在恒温发酵下，20℃和40℃下发酵获得的鱼露TVB－N含量都较低，而30℃发酵鱼露的TVB－N含量最高。另一方面，利用20－30℃方式发酵得到的鱼露其TVB－N含量明显比30℃恒温发酵的鱼露少，而且利用20－30－40℃逐级升温发酵方式获得的鱼露TVB－N含量最低。通常，TVB－N是指鱼露中蛋白质、小分子肽、氨基酸等在微生物的作用下分解形成氨、三甲胺等碱性含氮化合物，是用来衡量鱼露腐败变质的一个重要指标［19］。因此，加曲速酿鱼露在30℃发酵时，可能由于腐败微生物容易繁殖，结果导致鱼露产品TVB－N含量增加。然而，利用先低温后高温分段保温发酵方式可以减少鱼露产品TVB－N含量，表明这种发酵方式可以抑制发酵过程中腐败微生物的生长繁殖。

2.3.2 游离氨基酸组成的分析 据报道，谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等游离氨基酸(FAA)是鱼露的主要呈味氨基酸［20］。因此，以特级商品鱼露为对照，对不同发酵方式获得的鱼露的FAA组成进行测定，并对鱼露呈味氨基酸进行归类分析［20－21］，结果如表7所示。由表可知，100mL商品鱼露中含有8.4g左右的FAA，鲜味氨基酸和甜味氨基酸占总的FAA比例分别达到37.1%和42.2%，尤其谷氨酸和甘氨酸的比例分别高达33.7%和27.5%，这可能是商品鱼露被勾兑的缘故。利用恒温发酵方式经过90d发酵制备低盐鱼露时，随着发酵温度的升高，鱼露中FAA总量和苦味氨基酸的比例都出现上升的趋势，但鲜味氨基酸比例却出现下降。当采用分段发酵方式经过90d发酵制备低盐鱼露时，鱼露中FAA总量增加，而苦味氨基酸的增加趋势明显得到抑制，表明该发酵工艺有利于改善加曲低盐速酿鱼露的品质。

2.3.3 鱼露的感官评价 表8显示了经过90d发酵制备的各种鱼露的感官评价结果。在气味方面，商品鱼露除了具有较高的酱香味和肉香味以外，还具有较强的鱼腥味。恒温发酵获得的鱼露尤其是在30℃下发酵时鱼腥味最强，接近商品鱼露，但随着发酵温度的升高或下降，鱼露的鱼腥味都出现减弱现象。而且当采用分段发酵方式时，鱼露的鱼腥味进一步减弱。通常，鱼腥味主要是氧化三甲胺在酶和微生物作用下生成三甲胺引起的。30℃发酵下可能由于腐败微生物繁殖比较快，导致产品的鱼腥味偏高。另一方面，提高发酵温度将促进酱醅中氨基酸和糖发生美拉德反应，反应生成物可能遮盖部分的鱼腥味，使40℃恒温发酵和20－30－40℃分段发酵得到的鱼露中鱼腥味减弱。胺味是鱼露的另一项不良气味，感官评价结果表明，发酵温度对鱼露胺味的影响趋势与鱼腥味类似。此外，加曲发酵鱼露的酱香味、肉香味分值与商品鱼露接近，而且温度和发酵方式对其没有产生明显的影响。

在滋味上，由于曲中乳酸菌繁殖旺盛的缘故，结果导致加曲发酵鱼露产品的酸味分值比商品鱼露高，但利用分段发酵方式可以得到明显的改善。采用40℃发酵后鱼露中出现一定程度的苦味，这可能是该发酵温度下鱼露中产生的苦味氨基酸比例偏高的缘故(表7)。此外，温度和发酵方式对鱼露的鲜味没有产生明显的影响。因此今后将继续优化先低温后高温分段发酵工艺，减少40℃发酵时间，进一步缩短低盐鱼露的生产周期。本研究制备的鱼露盐分含量为11.7%～12.6%，远低于商品鱼露的28.2%，如果适当提高鱼露的盐分含量可能还会增强产品鲜味。

由于传统鱼露生产周期长，因此国内外许多学者对速酿工艺已经开展了大量的研究，其中外加酶发酵工艺生产周期最短，有的发酵周期仅为15d左右［22］，但制备的鱼露风味物质含量低，感官质量不如传统发酵鱼露。当利用蛋白酶结合生物发酵剂速酿鱼露时，发酵时间需要120d左右［23］。因此，综合考虑发酵时间和鱼露品质，采用本研究的控温加曲速酿工艺生产低盐鱼露将具有更大的优势。

3 结论

3.1 恒温发酵下，提高发酵温度可以促进鱼肉蛋白的分解和溶出，有助于提高鱼露中的 AA－N、TS－N含量。然而30℃恒温发酵可能会促进腐败微生物的生长繁殖，导致发酵后期酱醅的pH迅速上升，鱼露中TVB－N含量偏高。过高的发酵温度(40℃)会使鱼露中的鲜味氨基酸和甜味氨基酸比例下降，苦味氨基酸比例升高，表现为感官分析时可以感觉到苦味。

表7 鱼露中游离氨基酸的组成(FAA，g/100mL)Table 7 Free amino acid compositions(FAA，g/100mL)of fish sauces

表8 鱼露的感官评价Table 8 Sensory evaluation of fish sauces

3.2 采用先低温后高温分段发酵，鱼露中的各种理化指标都可以得到改善，感官评价也获得好评。因此，本研究结果表明，采用先低温后高温分段发酵方式将促进加曲速酿低盐鱼露的生产工艺投入实际应用。

［1］绍伟，王栋，陈菽，等.淡水鱼下脚料速酿鱼露及脱腥技术初探［J］.食品研究与开发，2006，127(11):142－144.

［2］孙美琴.鱼露的风味及快速发酵工艺研究［J］.现代食品科技，2006，22(4):280－283.

［3］邵懿，薛长湖，李兆杰，等.超高压对鳀鱼蛋白水解的影响［J］.食品与发酵工业，2007，33(6):41－44.

［4］马永钧，戴秀华.利用酶技术生产鱼酱油加工工艺初探［J］.浙江海洋学院学报:自然科学版，2004，23(3):252－254.

［5］Klomklao S，Benjakul S，Visesanguan W，et al.Effects of the addition of spleen of skipjack tuna(Katsuwonus pelamis)on the liquefaction and characteristics of fish sauce made from sardine(Sardinella gibbosa)［J］.Food Chemistry，2006，98(2):440－452.

［6］Uchida M，Ou J，Chen B，et al.Effects of soy sauce Koji and lactic acid bacteria on the fermentation of fish sauce from freshwater silver carp Hypophthalmichthys molitrix［J］.Fisheries Science，2005，71(2):422－430.

［7］Asbjørn G，Jasmin EH，Florian MO.Acceleration of autolysis during fish sauce fermentation by adding acid and reducing the salt content［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1984，35(12):1363－1369.

［8］刘长霞，刘玉仙，朱敏，等 .低盐酱油的防霉措施［J］.中国调味品，1997，218(4):22－24.

［9］杨颖，陆胜民，陈剑兵，等.鳀鱼鱼露的加曲、分段速酿工艺［J］.食品与发酵工业，2009，35(11):87－91.

［10］高向阳.食品分析与检验［M］.北京:中国计量出版社，2008.

［11］Conway E J.Micro－difusion analysis and volumetric error［M］.London:Crosby Lockwood and Son Ltd，1950.

［12］Fukami K，Ishiyama S，Yaguramaki H，et al.Identification of distinctive volatile compounds in fish sauce［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2002，50(19):5412－5416.

［13］Steel R G D，Torrie J H.Principles and procedures of statistics:a biometrical approach［M］.New York:McGraw－Hill，1980.

［14］冷耀宗.鱼露发酵和pH变化规律初探［J］.中国调味品，1988(8):9－10.

［15］陈瑜珠，陶红丽，曾庆孝，等.利用罗非鱼加工下脚料发酵鱼露的研究［J］.现代食品科技，2008，24(5):441－443.

［16］侯温甫，黄泽元，汪秀文，等.淡水鱼加工下脚料速酿低盐鱼露的工艺研究［J］.食品科学，2009，30(23):322－325.

［17］黄紫燕，晁岱秀，朱志伟，等.鱼露快速发酵工艺的研究［J］.现代食品科技，2010，26(11):1207－1211.

［18］黄志斌.甲醛滴定氮作为酱油和鱼露质量指标问题的商榷［J］.中国调味品，1979(3):55－57.

［19］刘培芝.谈谈提高鱼露质量的一些技术措施［J］.中国调味品，1989(3):15－18.

［20］刘培芝.鱼露的鲜味［J］.食品科学，1989(4):37－40.

［21］Park J N，Fukumoto Y，Fujita E.Chemical composition of fish sauces produced in southeast and east asian countries［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2001，14(2):113－125.

［22］薛佳，曾名湧，董士远，等.罗非鱼加工下脚料速酿低盐优质鱼露的研究［J］.中国调味品，2011，36(4):41－47.

［23］Yongsawatdigul J，Rodtong S，Raksakulthai N.Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter culture［J］.Journal of Food Science，2007，72(9):382－390.