柠檬酸提取海带渣中多糖及其抗氧化活性与结构的研究

卢茳虹，林宗毅，崔 春，游丽君，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

海带属于褐藻门(Phaeopayta)海带目(Laminariales)海带科(Laminariaceaae)海带属(Laminaria)的一种大型海藻，含有多种生物活性成分［1］。海带多糖是存在于海带细胞间和细胞内的一类天然生物大分子物质，具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫和抗病毒等作用［2］。海带多糖的多样生物活性以及在功能性食品和药品上的应用，使对其的开发利用和研究日益活跃。目前，热水提取法是制备海带多糖的主要方式，而提取完后的大量海带渣将作为废料丢弃。然而水提法耗能多，提取时间长，且多糖得率较低，故海带渣中尚残留有大量的多糖。因此，寻找一种有效的提取方法来最大程度地提取海带渣中的多糖具有重要意义。酸提法可有效地降解多糖糖苷键，使更多的小分子量多糖分子溶解出来，提高多糖提取率和纯度［3］。目前国内外研究酸提法的酸原料仍局限于盐酸，且存在多糖降解程度难以控制等问题［4］。柠檬酸作为一种弱酸，可使整个提取过程都保持在一定酸度下进行，一方面可有效地降解残留在海带渣中的大分子物质，使多糖溶出，提高得率;另一方面有效降解部分糖苷键，提取具有较高活性的小分子多糖，提高多糖抗氧化活性［5］。先前的研究中已对柠檬酸提取海带多糖的工艺及其抗氧化活性做了较详尽的论述［6］。本文在此基础上，以传统水提后的海带渣作为原料，采用柠檬酸提取法对海带渣进行再次提取，并将海带渣多糖与直接酸提的海带多糖进行抗氧化与结构比较，以期为更好地开发利用海带提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干海带 采购于山东省烟台，采收于九月，清洗后晒干，粉碎过40目筛，置于干燥器中储存备用;DPPH(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazy)、ABTS(2，2－Azino－bis(3－ethylbenzothia－zoline－6－sulfonic acid))、Trolox、FL(Fluorescein)及 AAPH(2，2’－azobis(2－methylpropionamidine)－dihydrochloride) 美国Sigma公司;柠檬酸、氢氧化钾、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、铁氰化钾、氯化铁、三氯乙酸等 广州精科试剂有限公司，分析纯。

DFT200型手提式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;GT7C2A立式杀菌锅 温州市安福防腐机械厂;pHS－3EpH计 北京雷磁仪器公司;GL－21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;RE－52AA旋转蒸发仪 上海生物有限公司;Unico UV－2000型紫外可见分光光度计 尤尼科仪器有限公司;Varioskan Flash多功能酶标仪 芬兰Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取方法

1.2.1.1 水提后酸提法 海带干粉→热水提取(120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→过滤得海带渣→烘干→柠檬酸提取(pH2柠檬酸溶液、120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→取上清液，用氢氧化钾调pH至中性→浓缩→醇沉(乙醇最终浓度为80%)→4℃静置8h→取沉淀物→复溶沉淀物→除蛋白、脱盐→冻干→海带渣多糖。

1.2.1.2 直接酸提法 海带干粉→柠檬酸提取(pH2柠檬酸溶液、120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→取上清液，用氢氧化钾调pH至中性→浓缩→醇沉(乙醇最终浓度为80%)→4℃静置8h→取沉淀物→复溶沉淀物→除蛋白、脱盐→冻干→海带多糖。

1.2.2 多糖测定 本实验采用苯酚－硫酸法测定多糖提取率［7］。

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 将分析纯葡萄糖105℃烘干至恒重，取葡萄糖100mg定容于1L容量瓶中，配制成浓度为100mg/L的葡萄糖标准溶液。精密移取葡萄糖标准溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL用蒸馏水将溶液补至2mL，加入6%苯酚溶液1mL，迅速加入5mL浓硫酸，充分振荡摇匀后，室温下放置20min，测定490nm处溶液的吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，对应吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 多糖提取率的计算 多糖提取率(%)=提取液中多糖含量/所用海带总量×100

1.2.3 氧自由基清除能力(ORAC值)的测定 参照Hua等［8］的方法并加以改进。FL(荧光素钠盐)、AAPH(自由基产生剂)、标准抗氧化物质Trolox(维生素E水溶性类似物)以及待测样品均用75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.40)溶解和稀释。具体操作为:在96孔板各微孔中分别加入缓冲溶液20μL、样品20μL及FL(70nmol/L)20μL后，添加在37℃下预置15min，迅速在各孔中加入 AAPH(12.8mmol/L)140μL后运行程序，在37℃下以激发波长485nm，发射波长538nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度，测定 120min，荧光强度分别记为 f0、f1、f2…f60。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据公式，统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，然后根据公式Net AUC=AUCsample－AUCblank，分别计算不同浓度 Trolox(0～100μmol/L)和海带多糖的Net AUC值，其中AUCblank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。根据回归方程计算得出两种多糖的ORAC值，ORAC值以μmol Trolox/g表达。

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定 参照游丽君等［9］的方法并加以改进。配制 DPPH自由基溶液(0.2mmol/L，溶于无水乙醇)，DPPH自由基乙醇溶液在517nm处有紫色基团特征吸收峰，将多糖溶液按一定梯度稀释。将2mL DPPH溶液置于试管中，加入2mL海带多糖溶液，振荡混匀，室温避光放置30min后，在517nm处测其吸光值(Ai);以2mL无水乙醇加入2mL蒸馏水调零;对照为2mL DPPH溶液加上2mL无水乙醇在测定波长下的吸光值(Ac)，2mL海带多糖溶液和2mL无水乙醇混合后在测定波长的吸光值为Aj。根据公式R(%)=［1－(Ai－Aj)/Ac］×100，计算清除率R。以0～100μmol Trolox清除DPPH自由基能力做标准曲线，两种多糖样品每个至少测定三个浓度并呈线性关系，计算平均Trolox当量。

1.2.5 ABTS自由基清除能力测定 参照游丽君等的方法并加以改进［9］。ABTS自由基储备液的制备:以去离子水将ABTS和过硫酸钾K2S2O8分别溶解并混合，使其终浓度分别为14mmol/L和4.9mmol/L，在室温避光条件下静置12～16h。测定时，将ABTS自由基储备液以50%乙醇溶液稀释，使其在734nm时吸光度达0.70±0.02，形成ABTS自由基测定液。取2.9mL ABTS自由基测定液，加入0.1mL样品稀释液或Trolox，准确振荡30s，测定反应20min后在734nm处的吸光值。以0～200μmol Trolox的还原能力做标准曲线，两种多糖样品每个至少测定三个浓度并呈线性关系，计算平均Trolox当量。

1.2.6 还原力的测定 参照游丽君等［9］的方法并加以改进。样品2mL加到2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2mL 1%(w/v)的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2mL 10%(w/v)的TCA，混合后以3000r/min离心10min，取上清液2mL与2mL蒸馏水以及0.4mL 0.1%(w/v)氯化铁在反应试管中反应，10min后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大，表明该样品的还原力越强。以0～300μmol Trolox的还原能力做标准曲线，两种多糖样品每个至少测定三个浓度并呈线性关系，计算平均Trolox当量。

1.2.7 分子量的测定 样品的制备:将冷冻干燥后的两种多糖溶于0.02mol/L磷酸二氢钾溶液，制成2.0mg/mL的溶液，以10000r/min高速离心机离心后去取上清液，采用凝胶渗透色谱(GPC)测定分子量。GPC色谱条件:进样20μL，流动相为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液，流速为0.6mL/min，Waters 2410示差折光检测器检测。

1.2.8 红外分析 称取两种提取方法的多糖1～2mg，用KBr混合压片法在4000～500cm－1范围进行红外扫描。

2 结果与讨论

2.1 海带渣与海带中的多糖提取率

由表1可知，柠檬酸提取法可从水提后的海带渣中提取7.00%的多糖(根据葡萄糖标准曲线计算多糖提取率，回归方程为y=6.5048x+0.0166，R2=0.997)，而直接酸提法具有较高的多糖提取率。海带含有大量的褐藻酸钠，又称海带胶，是一种亲水性胶体，在传统水提取条件下，提取液易呈凝胶状，使多糖的溶解率偏低，故尚有大量的多糖残留在海带渣中。但由于酸的存在，褐藻糖胶易发生部分水解，提高多糖的溶出，从而可更大程度地从海带中提取多糖。此外，选择柠檬酸这种弱电离的有机酸，可有效地控制多糖水解程度。

表1 海带渣与海带中的多糖的提取率Table 1 The extraction yieldof Laminaria japonica and its residue

2.2 海带渣多糖与海带多糖抗氧化能力比较

由表2可知，在氧自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力与还原力这四种抗氧化能力指标中，水提后酸提的海带渣多糖与直接酸提的海带多糖的抗氧化能力相似，且两种提取方式的多糖ORAC值均比抗氧化剂BHT高。

氧自由基清除能力分析法是一种基于氢原子转移(HAT)的方法，一般认为基于HAT机制的方法最接近生理环境真实氧化过程，是目前抗氧化研究领域最受关注的评价方法之一［10］。根据Net AUC值与Trolox浓度建立的直线回归方程为:y=0.3325x+4.174(R2=0.9903)。由表2可知，海带渣多糖的ORAC值为 130.13μmol Trolox/g，是海带多糖的ORAC值的91.31%，且是抗氧化剂BHT的2倍多。Hua等［8］人研究长裙竹荪多糖的体外抗氧化能力发现，长裙竹荪多糖的ORAC值为115.77μmol Trolox/g。实验结果表明，两种提取方式下的海带多糖均具有较好的氧自由基清除能力，且海带渣多糖与海带多糖的ORAC值无明显差别。DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和还原力分析法均是基于电子转移(ET)的方法，是检测样品抗氧化活性的常用方法，具有快速、简便、经济等优点［11］。由表2可知，两种提取方式的多糖在这三种抗氧化指标上结果相近。其中，海带渣多糖的DPPH自由基清除能力是海带多糖的92%;海带渣多糖ABTS自由基清除能力是海带多糖的77.2%，差别稍大;海带渣多糖的还原力是海带多糖的95.16%。研究表明，海带渣多糖在抗氧化能力上与海带多糖相当，两种提取方式的多糖均具有较好的抗氧化活性。

表2 水提后酸提的海带渣多糖与直接酸提的海带多糖抗氧化能力(μmol Trolo×/g)Table 2 The antioxidant activities of polysaccharides by citric acid extraction after water extraction(μmol Trolo×/g)and direct citric acid extraction

2.3 海带渣多糖与海带多糖分子量比较

水提后酸提的海带渣多糖与直接酸提的海带多糖的凝胶色谱图如图1所示。海带渣多糖主要洗脱出两个峰，其中峰1的平均分子量为310182u，占2.73%，峰2的平均分子量为30515u，占97.27%，是海带多糖分子量的1.8倍，表明海带渣多糖可能至少含有两种不同分子量的多糖。而直接酸提的海带多糖只洗脱出一个主峰，平均分子量为17122u。多糖的结构与生物活性存在一定关系，Hou等人［12］发现多糖的分子量对其抗氧化活性起着重要的作用，经双氧水降解的低分子量海带多糖具有更好的清除自由基能力。通过辐照获得的低分子量海带多糖可显著地提高抗氧化活性［13］。本实验主要采用柠檬酸提取法，由于酸的作用，多糖的糖链被有效地降解，故两种多糖的主要分子量均小于海带天然大分子量多糖(平均分子量为 150000u)［14］。实验证明，海带渣多糖的抗氧化活性略比海带多糖的低，而其分子量比海带多糖的高，这结果也进一步验证了低分子量多糖具有较高的抗氧化活性。

2.4 海带渣多糖与海带多糖的红外光谱结果比较

图1 水提后酸提的海带渣多糖与直接酸提的海带多糖的分子量Fig.1 The molecular weight of polysaccharides extracted by citric acid extraction after water extraction and direct citric acid extraction

水提后酸提的海带渣多糖和直接酸提的海带多糖的红外光谱比较相似，在4000～400cm－1区间有多糖类物质的一般特征吸收峰，如图2所示。海带渣多糖与海带多糖在3045cm－1的强烈吸收峰为O－H的伸缩振动，属于分子内氢键的吸收峰。在2930、2929cm－1的小尖峰为糖类C－H的伸缩振动。海带渣多糖在 1607、1416、1298、1034cm－1处与海带多糖在1605、1413、1298、1038cm－1处的吸收峰为 C=O 非对称伸缩振动、C－O伸缩振动和O－H变角振动，属于羧基的特征峰，表明可能含有糖醛酸［15］。在1257、1259cm－1的吸收峰为－O－SO3－的 S=O 伸缩振动，说明多糖可能含有硫酸基［16］。在 889、890cm－1处的吸收峰为β－端基差向异构的C－H变角振动，为吡喃环的特征吸收峰;817、819cm－1处的吸收峰是半乳吡喃糖的特征峰;此外，930～960cm－1区域为糖的吡喃环的振动谱。这几个尖峰表明海带渣多糖和海带多糖均为吡喃糖。红外光谱图表明两种提取方式下的多糖具有相似的结构，具体的结构特点(如单糖组成、硫酸基含量、糖醛酸含量等)还有待进一步研究。

图2 水提后酸提的海带渣多糖与直接酸提的海带多糖的红外光谱图Fig.2 IR spectra of polysaccharides extracted by citric acid extraction after water extraction and direct citric acid extraction

3 结论

3.1 以水提后的海带渣为原料，采用柠檬酸提取法进行再次提取，可提高海带提取多糖的利用率。水提后酸提的海带渣多糖的抗氧化活性与直接酸提的海带多糖相当，具有较好的氧自由基清除能力、DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力，其中ORAC值比抗氧化剂BHT高2倍。

3.2 对水提后酸提的海带渣多糖进行分子量测定与红外光谱图分析，结果表明海带渣多糖与直接酸提的海带多糖结构相似，具体结构特点(如单糖组成、硫酸基含量、糖醛酸含量等)有待进一步研究。此外，低分子量多糖的高活性特点与其结构的关系也值得进一步探讨。

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