石榴皮提取物体外抗氧化活性比较研究

唐鹏程，焦士蓉，唐远谋，符雷蕾

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

石榴皮提取物体外抗氧化活性比较研究

唐鹏程，焦士蓉*，唐远谋，符雷蕾

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

研究石榴皮提取物的体外抗氧化作用。采用羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O2-）、2，2-二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的生成体系，研究石榴皮提取物及绿茶多酚、没食子酸为对照，对自由基的清除能力和对小鼠肝组织匀浆脂质过氧化抑制作用。结果表明：石榴皮提取物对羟自由基、超氧阴离子、DPPH·的半清除率分别为：IC50=71.37 mg/mL、SC50=557.55 mg/mL、DC50=31.98 mg/mL；没食子酸对这3种自由基的半清除率分别为：IC50=51.85 mg/mL、SC50=289.2mg/mL、DC50=37.65mg/mL；绿茶多酚对这3种自由基的半清除率分别为：IC50=66.67mg/mL、SC50=1043.91mg/mL、DC50=22.48 mg/mL。石榴皮提取物对小鼠肝组织匀浆的脂质过氧化半抑制率EC50=5.21 mg/mL、没食子酸半抑制率EC50=22.82 mg/mL、绿茶多酚半抑制率EC50=3.47 mg/mL。研究表明石榴皮提取物较没食子酸和绿茶多酚具有良好的清除自由基及抑制脂质过氧化的能力。石榴皮提取物能有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·自由基，抑制脂质过氧化作用，具有进一步研究和开发价值。

石榴皮；羟自由基；超氧阴离子自由基；DPPH·；脂质过氧化；抗氧化

自由基在人体内处于不断产生和不断清除的动态平衡中，自由基产生过多或清除过少，就会造成对组织的伤害[1]。Harman[2]在总结前人研究的基础上完善了自由基理论：认为自由基攻击生命大分子从而造成组织细胞损伤，是引起机体衰老、肿瘤和一些其它疾病的根本原因。

近年来，国内外研究表明[3-4]，石榴皮多酚具有显著的抗氧化和清除自由基作用,石榴皮作为天然的抗氧化剂，来源广泛、提取率高、抗氧化活性强、与机体亲和力强和安全性高等特点具有合成抗氧化剂无法比拟的优势，是今后的研究重点。现代医学和自由基科学越来越多地证明自由基与许多生命现象的疾病密切相关[5]。石榴皮多酚提取物能有效的清除自由基起到抗氧化作用，有效地防止自由基对健康细胞的破坏作用，有效地防止机体衰老。

本次在提取石榴皮总多酚的基础上，研究石榴皮提取物对羟自由基、2，2-二苯代苦味酰基自由基、超氧阴离子自由基的清除作用和抑制脂质过氧化的能力，为开发高效天然抗氧化剂提供一些基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴皮：产于四川会里，购于成都中药饮品有限公司；绿茶多酚对照品：WAGON公司；没食子酸对照品：中国药品生物制品检定所；福林-酚试剂（Folin-Ciocalteu's phenol reagent）、2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：sigma；其余试剂均为分析纯。

清洁级昆明小鼠，雄性，体重18 g～20 g：由四川大学实验动物中心提供。

UV－2600型紫外可见分光光度计：尤尼柯上海光谱仪器有限公司；过滤装置：郑州杜甫仪器厂；BT－423S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Heto Lyolab 3000冻干机：Denmark；微波萃取仪：上海新仪微波化学科技有限公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂，等。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮提取物的制备

采用通过响应面法优化得到的最佳提取工艺提取石榴皮多酚，微波辅助提取工艺条件为：筛目大于80目、温度75 ℃、料液比1∶30、提取时间140 s，提取溶剂为蒸馏水，依照此条件获得的提取液进行旋转蒸发浓缩和冷冻干燥，采用福林-酚比色法测得冻干粉末总多酚含量为49.31%。

1.2.2 抗氧化方法

1）羟自由基（·OH）的清除：采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（Fonton反应）方法[6]。取0.75mmol/L邻二氮菲溶液1 mL，磷酸缓冲液（PBS）2 mL和蒸馏水1 mL，充分混匀后，加0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL，混匀，加0.01%的过氧化氢1mL，于37℃保持60min，于536nm处测其吸光度，其值为AP。用1 mL 30%的乙醇代替1 mL过氧化氢，测得吸光度为AB。用试样1 mL代替1 mL蒸馏水，测得吸光度为AS。按下式计算·OH清除率（d1）：

2）2，2-二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除：参照文献[7]，并作适当修正。准确称取DPPH·标准品10 mg，无水乙醇定容至250 mL，得质量浓度为0.04 g/L溶液。取此溶液3mL，加入相同质量浓度样品溶液1 mL，摇匀，室温放置30 min，517 nm处测吸光度（Ai）。同时测1 mL溶剂与3 mL DPPH·混合后吸光度（Ac），1 mL样品液加3 mL乙醇混合后吸光度（Aj）。按下式计算DPPH·清除率（d2）：

3）超氧阴离子自由基（·O2-）的清除：参考文献[8]方法，取50 mmol/L、pH 8.2的Tris-HC1缓冲液4.5 mL于试管中，置25℃水浴预热20 min，加入不同质量浓度的待测样品0.1 mL，2.5 mmol/L邻苯三酚0.4 mL，混匀后在25℃水浴反应4 min，8 mol/L盐酸2滴终止反应，（299±1）nm处测定吸光度。空白组以0.1 mL蒸馏水代替待测样品溶液，并按下式计算·O2-清除率（d3）：

4）脂质过氧化抑制作用：参考文献[9]方法稍作修改，小鼠死后取肝洗净血污，剪碎用生理盐水制3%匀浆，取次液0.6 mL加入各种试剂，反应液总体积为1.34 mL，含不同浓度药液0.34 mL，0.0024%双氧水0.2 mL，0.03 mmol硫酸亚铁0.2 mL，37 ℃保温60 min，加入2 mL 20%三氯乙酸及2 mL 0.67%2-硫代巴比妥酸（TBA），90℃保温15 min后于4000 r/min离心20 min，取上清液测定A532nm处的吸光值，以水代替TBA为背景，以水代替药液为空白，并如下公式计算脂质过氧化抑制率（d4）：

2 结果与讨论

2.1 石榴皮提取物的自由基清除活性研究

2.1.1 对DPPH·的清除作用

以没食子酸和绿茶多酚为对照，测定石榴皮提取物的DPPH自由基清除活性和半抑制浓度的比较，结果见图1、图2。

石榴皮提取物半清除率DC50=31.98 mg/L、没食子酸半清除率DC50=37.65 mg/L、绿茶多酚半清除率DC50=22.48 mg/L。图2显示，石榴皮提取物的DPPH·清除活性高于没食子酸，低于绿茶多酚。

2.1.2 对羟自由基（·OH）的清除

以没食子酸和绿茶多酚为对照，测定石榴皮提取物对·OH（羟自由基）的清除活性，结果见图3，半抑制浓度的比较见图4。

石榴皮提取物半清除率IC50=71.37 mg/L、没食子酸半清除率IC50=51.85 mg/L、绿茶多酚半清除率IC50=66.67 mg/L。图4显示，石榴皮提取物的·OH清除活性低于绿茶多酚和没食子酸。

2.1.3 对超氧阴离子（·O2-）的清除

以没食子酸和绿茶多酚为对照，测定石榴皮提取物对·O2-的清除活性，结果见图5，半抑制浓度比较见图6。

石榴皮提取物半清除率SC50=557.55 mg/L、没食子酸半清除率SC50=289.20 mg/L、绿茶多酚半清除率SC50=1043.91 mg/L。图6显示，石榴皮提取物·O2-的清除活性高于绿茶多酚，是其清除活性的1.87倍，但低于没食子酸。

2.2 石榴皮提取物对脂质过氧化的抑制作用

以没食子酸和绿茶多酚为对照，测定石榴皮提取物对脂质过氧化的抑制作用，结果见图7，半抑制浓度的比较见图8。

石榴皮提取物半抑制率EC50=5.21 mg/L、没食子酸半抑制率EC50=22.82 mg/L、绿茶多酚半抑制率EC50=3.47 mg/L。图8显示，石榴皮提取物脂质过氧化抑制作用高于没食子酸，是其抑制作用的4.38倍，但低于绿茶多酚。

3 讨论

研究表明，氧化损伤是导致癌症和慢性疾病的一个重要机制，对蔬菜水果包括石榴汁的摄入量高，可降低心血管疾病和患癌症的风险[7]，因其富含多酚类化合物，具有清除自由基和降低氧化损伤带来的副作用，研究发现茶多酚等可作为抗氧化药物对心血管起保护作用[10]。

1）研究表明，石榴皮提取物具有较高的清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·的作用。与没食子酸和绿茶多酚抗氧化活性的比较表明，石榴皮提取物对DPPH·清除活性高于没食子酸，对·O2-的清除能力高于绿茶多酚，但对·OH的清除能力低于没食子酸和绿茶多酚，其中机制还有待进一步深入研究。

2）研究发现脂质过氧化的程度反映了机体自由基活性的高低及机体遭受自由基损伤的程度。自由基诱导的脂质过氧化反应与许多疾病的发生有密切关系，如炎症、老年性白内障、动脉粥样硬化、老年性痴呆、糖尿病并发症、衰老等[11]。石榴皮水提物具有抑制小鼠肝组织匀浆的脂质过氧化作用，且高于没食子酸对照，提示石榴皮可作为一种食品补充剂，降低氧化损伤带来的心血管疾病及慢性病的风险。

[1]凌关庭.抗氧化食品与健康[M].北京:化学工业出版社,2004:161-163

[2]Harman D.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry[J].J Gerontol,1956(11):298-300

[3]Singh R P，Chidambara Murthy K N，Jayaprkasha G K.Studies on the antioxidant activity of pomegranate peel and seed extracts using in vitro models[J].Joumal of agricultural and food chemistry,2002(50)：8l-86

[4]张茜,贾冬英,姚开,等.石榴皮提取物的抗氧化作用的研究[J].中国油脂,2006,31(8)：5l-54

[5]郑荣梁.自由基生命科学发展[M].北京：原子能出版社,1999:134-136

[6]金鸣,黎亚欣,李金荣,等.邻二氮菲-Fe2+28化法榆测H202/Fe2+产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理学进展,1996,23(6)：553-555

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Comparison and Study on the Antioxidant Activity of Pomegranate Peel Extract

TANG Peng－cheng，JIAO Shi－rong*，TANG Yuan－mou，FU Lei－lei
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

Antioxidative activity of Pomegranate Peel extract in vitro was studied.The effect of free radicals scavenging was investigated with different special chemical systems of hydroxyl radical（·OH），superoxide radicals（·O2－），1，1－dipheny－2－picryhydrazyl free radical（DPPH·）radical and inhibitor lipid－peroxidation with homogenates of mouse liver.Ability of Pomegranate Peel extract for half－inhibition of hydroxyl radical and superoxide radicals and DPPH· radicals was as follows：IC50＝71.37 mg/mL，SC50=557.55 mg/mL，DC50=31.98 mg/mL，respectively.Half－inhibition of gallic acid was ：IC50＝51.85 mg/mL，SC50=289.2 mg/mL，DC50=37.65mg/mL，respectively.Half－inhibition of greenteapoly phenols was：IC50＝66.67mg/mL，SC50=1043.91mg/mL，DC50=22.48 mg/mL，Inhibitive effects of Pomegranate Peel extract on lipid－peroxidation of homogenates of mouseliverEC50was5.21mg/mL，GallicacidEC50was22.82mg/mL，Greenteapoly phenols EC50was 3.47 mg/mL，respectively.Pomegranate Peel extract had a good inhibition against lipid-peroxidation.A linear relationship existed between free radicals scavenging ability and inhibitive effects on lipid-peroxidation with treatment of Pomegranate Peel extract.The extract of Pomegranate Peel can effectively scavenge free radical and inhibit lipid-peroxidation significantly.

Pomegranate Peel；hydroxyl radical；superoxide radicals；DPPH·；lipid－peroxidation；antioxidant

西华大学2008校人才培养与引进科研课题（R0820501）;四川省教育厅自然重点项目（09ZA158）

唐鹏程（1985—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品营养与安全。

*通信作者：焦士蓉（1968—），女，副教授，硕士生导师，博士，研究方向：食品生物技术。

2011-04-15