灵芝多糖清除自由基活性的研究

张志军，李淑芳，魏雪生

（天津市林业果树研究所，天津 300112）

灵芝（Ganoderma Lucidum）在我国自古就有“仙草”的美誉，已有悠久的药用和食用历史，如《神农本草经》、《本草纲目》中都有灵芝的药效记载[1]。多糖是灵芝中具有生物活性的主要有效组分之一。20世纪70年代以来，灵芝多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期，经过近30年的发展，人们对灵芝多糖这一类重要生命物质产生了新的认识[2]。据报道，从双孢蘑菇、灵芝、香菇、侧耳等6种真菌中提取出的活性成分，可以防止细胞内DNA的氧化损伤。刘志峰等的研究证明，蘑菇提取物对脂质过氧化的抑制率可达29%。真菌提取物对自由基有一定的清除作用[3]。真菌是自由基清除剂的良好载体。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，国内外基本上采用水浸法、碱浸法提取多糖，再经有机溶剂沉淀提纯。由于传统工艺采用碱浸、有机溶剂分离提纯等手段，易对灵芝多糖聚合体造成破坏；对某些活性基团也易造成变性失活，且粗多糖提取效率极低；膜分离技术是近年来发展起来的，在分子水平上实现机械分离的高新技术。由于它具有常温操作，无相态变化，高效节能，在生产过程中不产生污染等特点，且整个分离过程在密闭系统中进行，可避免和减轻热和氧对物料营养成分的影响，因此，膜分离技术被认为是21世纪最有前途的技术。因此，采用膜技术进行灵芝多糖的分离纯化，不仅收率高而且极少破坏灵芝多糖结构[4]。

因此，本文对灵芝多糖的还原能力及其对羟自由基(·OH)和超氧自由基(·O2-)的清除活性进行了研究探讨,并对不同工艺制取的灵芝多糖的清除自由基的能力进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝：由天津市林业果树研究所提供；

邻苯三酚、番红花T、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为分析纯；

恒温水浴箱：天津市泰斯特仪器有限公司；752分光光度计：上海第三分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 灵芝多糖制取方法

水提醇沉工艺：灵芝子实体→粉碎→粗滤→真空浓缩→醇沉→干燥

膜分离工艺：灵芝子实体→粉碎→预煮→粗滤→微滤→超滤→浓缩干燥

1.2.2 还原能力测定（铁氰化钾还原法）

在2.5 mL pH6.6磷酸缓冲溶液中加入1 mL提取物溶液，2.5 mL 1%铁氰化钾，混合物在50℃恒温条件下，加热20 min，急速冷却，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r/min离心分离，取上层清液2.5 mL，加2.5 mL水再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10 min后在波长700 nm下测吸光度A值。A700越大，则样品的还原力越强。

1.2.4 对超氧阴离子·O2-的清除作用

根据吴慧平的方法，邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化生成有色中间物（在420 nm处有最大吸收峰）和·O2-，·O2-对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断·O2-生成量的多少。实验体系为3 mL Tris-HCl缓冲液（pH8.2）和0.1 mL不同浓度的样品，25℃水浴20 min后加入3 mL浓度为7 mmol/L的邻苯三酚，反应4 min后加入10 mol/L的HCl终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在420 nm处测OD值。对照组以0.1 mL蒸馏水代替样品，空白组以不加邻苯三酚，根据清除率判断样品对·O2-生成的影响。

2 结果与讨论

2.1 灵芝多糖的还原能力测定

还原力法的原理为：K3Fe(CN)6+样品→K4Fe(CN)6+样品氧化物

在波长700 nm条件下测定吸光度A，A越大，则样品的还原能力越大。

灵芝多糖的抗氧化能力测定，见表1。可知0.10mg/mL多糖溶液的A700与水体系A700值相当，说明该浓度（均指加入反应体系的样品起始浓度，后同）下灵芝多糖没有还原能力。其后4个浓度，随着浓度的增大，A700值也增大，多糖的还原能力在试验浓度范围内有较好的量效关系。以30μg/mLVC溶液的还原能力作参比，1.00 mg/mL多糖溶液的还原能力强于VC。以相同起始样品浓度比较A700值，灵芝多糖还原能力明显低于VC的还原能力，但多糖溶液还原能力的存在说明多糖具有表现抗氧化作用的可能性。

表1 灵芝多糖的抗氧化能力测定Table 1 The determinatiing test of antioxidant activity of Ganoderma Lucidum polysaccharide

2.2 灵芝多糖的清除自由基实验

自由基产生过量可以引起生物膜和DNA的氧化性损伤,导致癌症、动脉硬化、衰老和多种老年慢性疾病,如使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应可以抑制机体的自由基损伤,从而保持最佳健康状态和防治这些疾病,延缓衰老。

多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧,减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行。对于·OH而言，可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；对于·O2-，多糖可与其发生氧化反应,达到清除的目的。

2.2.1 不同提取工艺对·OH的清除作用

不同提取工艺对·OH的清除作用见表2。

表2 不同多糖提取工艺对羟自由基（·OH）的清除作用Table 2 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·OH

由表2可知，随着多糖浓度的增加，对Fenton反应体系产生的羟基自由基的清除率增大，量效关系非常明显。在相同浓度下，新工艺多糖清除羟自由基的能力强于传统工艺，IC50分别为1.58、1.36。

2.2.2 不同提取工艺对·O2-的清除作用

不同提取工艺对·O2-的清除作用见表3。

表3 不同多糖提取工艺对超氧阴离子（·O2-）的清除作用Table 3 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·O2-

由表3可知，随着多糖浓度的增加，对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基的清除率增大，且量效关系非常明显。在相同浓度下，新工艺多糖清除超氧阴离子的能力强于传统工艺，IC50分别为2.83、2.55。

以上实验数据均表明，新工艺制取的灵芝多糖的清除自由基的能力强于传统工艺，这是因为，在灵芝多糖的制取过程中，传统工艺采用了有机溶剂和多次高温处理，使多糖的生物活性受到影响的缘故。

3 结论

1）灵芝多糖浓度在0.1 mg/mL时，A700与水体系相当，基本没有还原能力；在1.0 mg/mL时，多糖溶液的还原能力强于30 ug/mL的VC溶液；由多糖溶液的还原能力的存在说明多糖具有抗氧化作用的可能性。

2）对不同制取工艺的灵芝多糖的清除自由基能力进行比较，结果表明，膜分离工艺制取的灵芝多糖清除超氧阴离子·O2-和羟自由基·OH的能力均较好，并且清除能力和多糖的浓度存在明显的量效关系。

[1]马礼金.灵芝的药用及食用研究[J].食品与发酵工业,2000，24(1)：62-66

[2]蔺丽，方能虎，吴旦，等.灵芝的主要生物活性研究概况[J].中国食用菌，2000，21(3)：38-40

[3]肖建辉，将侬辉，梁宗琪,等.食药用真菌多糖研究进展[J].生命的化学，2002，22（2）：148-151

[4]刘建华，张志军.灵芝多糖提取与应用现状[J].保鲜与加工，2003，3（3）：9-10