诺丽发酵果汁抗氧化实验研究

李煦照，于纯淼，陈佳，刘树民，*

（1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

诺丽（Morinda citrigolia L.，Noni），也称海巴戟，属茜草科植物，是一种发源于南太平洋岛屿的热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木，富含多种营养成分。在太平洋群岛，波利尼西亚人和库克人认为他们的祖先应用海巴戟治疗疾病有2000多年的历史，主要用于抗感染和治疗慢性疾病，是波利尼西亚人和库克人最主要的药用植物之一，在民间广为应用[1]，传统用于抗衰老、糖尿病、口臭、口腔溃疡、痔疮、肿瘤、结核病、鱼肉中毒和高血压等。本试验研究发酵诺丽果汁对溴代苯所致小鼠急性肝损伤的抗氧化功能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

诺丽果汁：购于海口，自然发酵3个月，用蒸馏水配成所需浓度；溴代苯：天津市光复精细化工研究所，分析纯（临用前用食用油配成适宜浓度的供试液）；MDA、SOD、GSH-Px测定试剂盒及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验动物

昆明小鼠，雄性，体重18 g～22 g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK黑2008004。

1.1.3 主要仪器

KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；756紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；XHF-1内切式组织匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 前期给药

选18 g～22 g健康成年昆明小鼠，雄性，随机分成空白对照组、模型对照组和受试样品高、中、低剂量组，每组l0只。按成人体重60 kg计，受试样品每次用量为50 mL，1 d 2次，相当于1.66 mL/（d·kg）。试验中按成人推荐用量的5、10、20倍，设高、中、低剂量组。浓度分别为0.21、0.42、0.84 mL/mL，以蒸馏水配制。经口给药，灌胃量为0.2 mL/10 g。30 d后取血测抗氧化酶活力（GSH－Px、SOD）。空白对照组经口给予同体积溶剂。

1.2.2 造模方法

按《保健食品检验与评价技术规范》[2]，给药30 d后，取血测抗氧化酶活力，此后动物饥饿过夜，第2天给予受试样品或溶剂1 h后，除空白对照组外，各组小鼠经口给护溴代苯油（3 mmol/L），灌胃量0.1 mL/10 g。20 h后处死动物，取肝组织测过氧化脂质含量（MDA）和抗氧化酶活力（GSH-Px、SOD）。

1.2.3 样品制备

1.2.3.1 血清样品

取血0.5 mL，4000 r/min离心10 min，取血清备用。

1.2.3.2 全血样品

取血20 μL加入到2.48 mL蒸馏水中，充分振摇，使之全部溶血，4 h内测定酶活力。

1.2.3.3 肝组织上清液

动物处死后，立即取出所需肝脏，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎片，称取适量组织，制成10%组织匀浆，操作在冰浴中进行。匀浆以4000r/min，4℃离心10min，取上清液备用。

1.2.4 各指标测定

本试验测定全血GSH-Px酶活力，血清总SOD活力，肝组织MDA含量，肝组织GSH-Px酶和总SOD活力。

1.2.4.1 GSH-Px活力测定

采用二硫代二硝基苯甲酸法(DTNB法)。

1）取1∶124全血0.2 mL测全血GSH-Px酶活力

全血GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（标准管OD值－空白管OD值）×标准液浓度（20μmol/L）×5×（1+124）/（1+49）

2）取0.25%组织匀浆0.2 mL测组织中GSH-Px酶活力

组织中GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（标准管OD值－空白管OD值）×标准液浓度（20μmol/L）×5/反应时间/（取样量×蛋白含量）

1.2.4.2 SOD活力测定

采用黄漂吟氧化酶法。

1）取血清20 μL测定总SOD活力

总SOD活力/（U/mL）=（对照管吸光度－测定管吸光度）/对照管吸光度/50%×反应体系稀释倍数×样本测试前的稀释倍数

2）取1%肝组织匀浆25 μL测定总SOD活力

组织匀浆中SOD活力/（U/mgprot）=（对照管吸光度－测定管吸光度）/对照管吸光度/50%×反应液总体积/取样量（mL）/组织中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.3 MDA含量测定

采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。

取10%肝匀浆0.1 mL测定MDA含量。

组织中MDA含量/（nmol/mgprot）=（测定管吸光度－测定空白管吸光度）/（标准管吸光度－标准空白管吸光度）×标准品浓度（10 nmol/mL）/组织中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.4 蛋白含量测定采用考马斯亮兰法

1.2.5 数据处理

2 结果与讨论

2.1 发酵诺丽果汁对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

发酵诺丽果汁高、中、低三剂量组中全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力均高于空白对照组，但无显著性差异，结果见表1。

肝损伤实验中，发酵诺丽果汁高、中、低三剂量组及空白对照组中肝组织谷胱甘肽过氧化物酶活力均低于模型对照组，但无显著性差异。高、中、低三组中，随着剂量的增加，谷胱甘肽过氧化物酶活力反而下降，结果见表2。

2.2 发酵诺丽果汁对小鼠超氧化物歧化酶活力的影响

发酵诺丽果汁中、低三剂量组血清超氧化物歧化酶活力均高于空白对照组，中剂量组显著高于空白对照组（P<0.05），高剂量组低于空白对照组，结果见表1。

表1 发酵诺丽果汁对小鼠抗氧化酶活力的影响(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

表1 发酵诺丽果汁对小鼠抗氧化酶活力的影响(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

注：*与空白组对比P<0.05。

组别GSH-Px/（μmol/L）SOD/（U/mL）空白对照组 221.76±72.60 138.10±12.08低剂量组 245.72±80.74 138.94±22.24中剂量组 268.32±68.36 170.28±10.49*高剂量组 244.83±83.25 135.41±12.46

表2 发酵诺丽果汁对肝损伤小鼠过氧化脂质含量和抗氧化酶活力的影响(肝组织)Table 2 Fermented Noni Juice on lipid peroxide content and the activity of antioxidant enzymes in liver injury mice（liver tissue）

肝损伤实验中，发酵诺丽果汁低剂量组中肝组织超氧化物歧化酶活力高于模型对照组，但无显著性差异，高、中及空白对照组均低于模型对照组，结果见表2。

2.3 发酵诺丽果汁对肝损伤小鼠过氧化脂质（MDA）含量的影响

模型对照组肝组织中过氧化脂质（MDA）含量显著高于空白对照组（P<0.05），中剂量组肝组织中过氧化脂质（MDA）含量显著低于模型对照组（P<0.05），高、低剂量组组织中过氧化脂质（MDA）含量则高于模型对照组，结果见表2。

3 结论

在正常情况下，机体内有一定数量的自由基，机体内的SOD、GSH-Px等酶可以有效的清除多余的自由基，使体内的氧化与还原反应保持着平衡状态。一旦体内的氧自由基大量产生或抗氧化系统功能减弱，都会导致组织细胞的氧化损伤。本实验肝组织中空白对照组与模型组MDA含量有显著性差异，造成了过氧化损伤模型。

肝组织中，GSH-Px活力随着发酵诺丽果汁剂量的增加而降低，总体呈逐渐下降趋势，提示发酵诺丽果汁具有非常强的抗自由基作用，基本能消除自由基对肝组织的伤害，对肝组织具有一定保护作用[3]。而各剂量组肝组织中的SOD活性无明显变化，推测可能与其在试验中活性代偿性反应有关[4]。

各剂量组血中GSH-Px与SOD活力均高于空白对照组，提示发酵诺丽果汁对于未造成过氧化的动物具有增高抗氧化酶活力作用。

实验结果表明发酵诺丽果汁可以通过减少膜脂质过氧化产物，提高机体清除氧自由基能力，强化抗氧化解毒系统，对肝细胞氧化损伤起到一定保护作用。

[1]彭勇,肖伟,刘勇,等.世界药用植物新宠——海巴戟果[J].国外医药·植物药分册,2007,22(3):93-96

[2]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003:43

[3]马文涛,杨来启,杨喜民,等.维生素C对应激大鼠脑内超氧化物歧化酶含量的影响[J].中国心理卫生杂志,2002,16(12):809-810

[4]Gaohua,Zhou yawei.Anti-lipid peroxidation and protection of liver mitochondri against injuries by picrosideⅡ[J].World J Gastroenterol,2005,11(24):3671