液质联用技术测定茶叶中多菌灵残留

田艳铃，王浩

（国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094）

多菌灵又名棉萎灵，是一种高效、低毒、广谱、内吸性杀菌剂，对多种作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。其作用机理是通过干扰菌体细胞纺锤体的形成，干扰细胞分裂，对植物具有良好的保护和治疗作用。在茶树上,主要用于防治茶芽枯病、茶白星病、茶轮斑病、茶褐色叶斑病等叶部病害和茶枝梢黑点病等。多菌灵的化学性质稳定,残效期长，人们长期饮用含有多菌灵残留的茶水可能引起慢性中毒。目前，我国对茶叶设定的限量为5.0mg/kg，日本的肯定列表制度对茶叶设定的限量为0.1 mg/kg，而我国茶叶中多菌灵残留国家标准检测方法检出限为0.2mg/kg，这无疑增加了我国茶叶对日出口的风险。

目前，茶叶中多菌灵残留的分析方法主要有荧光分析法、红外光谱法、气相色谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法等。其中，薄层扫描法灵敏度较低；荧光法操作较繁琐且易受干扰；气相色谱法需要对样品进行衍生化处理,易造成多菌灵损失；高效液相色谱法前处理或者毒性较大（如用苯做提取液）[1]，或者仪器要求较高（如需要用凝胶渗透色谱仪或溶剂快速提取仪等前处理仪器）[2-3]，直接影响方法的适用范围。

本文确定了用0.2 moL/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）超声提取样品，OASIS MCX固相萃取柱净化富集，采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法进行定性定量分析，取得满意效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1.1.1 仪器

液相色谱-串联质谱仪：Agilent 6410型串联三重四极杆质谱，配Agilent1200型液相色谱仪（Agilent公司，美国；KQ-5200型超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q去离子水发生器：Milli-Q公司，美国；RE-2000型旋转蒸发仪：上海市亚荣生化仪器厂；NEVADTM 111型氮气吹干仪：Organomation Association公司，美国；TGL-16M型高速台式冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.1.2 试剂和材料

乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；盐酸（分析纯）；氨水（分析纯）；多菌灵购自国家标物中心，纯度为98%～99%；OASIS MCX固相萃取柱（美国waters公司，3cc，60 mg）；实验所选用材料为本单位所检验样品。

1.2 分析条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱：3.0 mm×50 mm，1.8 μm；流速：0.25 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相0.1%甲酸的水溶液+乙腈，洗脱梯度见表1。

表1 分离多菌灵的较佳洗脱梯度Table 1 Optimal elution condition for separation of Carbendazim

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2；雾化气压力：275.8 kPa；干燥气温度：340 ℃；干燥气流速：8 L/min。多菌灵质谱分析的条件参数见表2。

表2 多菌灵的质谱参数Table 2 Parameter of Mass spectra of Carbendazim

1.3 样品处理

准确称取1.25 g样品，精确至0.01 g，置于25 mL具塞比色管中，用0.2 moL/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）定容至刻度，超声提取40 min，8000 r/min离心10 min，准确移取上清液10 mL至50mL烧杯中，将溶液以1 mL/min左右的流速通过固相萃取柱，待溶液完全流出后，先用3 mL 0.2 mol/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）冲洗烧杯合并过柱，然后再用3 mL甲醇淋洗萃取柱，最后用4 mL含4%氨水的甲醇溶液洗脱萃取柱，氮气吹干，再加入1 mL 50%甲醇水溶液，混合摇匀，进样10 μL进行液相色谱-串联质谱分析。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的的优化

茶叶中成分复杂，色素含量较高，而多菌灵属于碱化合物，在酸性条件下易于溶解，因此本方法通过0.2 mol/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）提取样品中的多菌灵。超声波促使样品中的多菌灵更充分地溶于提取溶液中，简化了处理过程。通过对比实验证明，超声提取40 min能使样品中多菌灵充分溶出（加标回收率>85.0%），因此，选择此溶液作为样品提取液。

2.2 固相萃取柱的选择

固相萃取柱是利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附，使目标化合物与基体干扰物分离，再用洗脱液淋洗达到净化和富集的目的。因为多菌灵是碱性化合物，所以本方法选择阳离子交换-反相萃取柱。实验发现：OasisMCX（美国 waters公司，3cc，60mg）萃取柱能提供对多菌灵的较强保留能力，分别通过0.2 mol/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）和甲醇淋洗萃取柱，能有效地消除样品中天然色素及非碱性化合物的干扰，净化效果比较理想。

2.3 质谱条件的优化

首先采用100 ng/mL的多菌灵标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定多菌灵的分子离子为m/z192.1。按照欧盟委员会指令2002/657/EC对定性分析的要求，选取1个母离子及其2个子离子或2个母离子及其各1个子离子，并依据子离子相对丰度比即离子比（定性离子／定量离子）和化合物的保留时间来定性。因此，本方法以m/z192.1为母离子，对母离子进行轰击以获得二次碎裂产生的子离子，选择丰度较高、干扰较小的离子对m/z 192.1>160.0，192.1>132.0作定性离子对（如图1所示），选择离子丰度最高的离子对m/192.1>160.0作定量离子对；在此基础上重点优化了对灵敏度影响较大的碰撞能量，使选定的子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳，从而得到多菌灵的最佳质谱参数（如表2所示）。

2.4 色谱条件的优化

多菌灵属于中等极性化合物，因此本方法采用梯度洗脱的方法提高分离效果，测试开始时，流动相中乙腈和0.1%甲酸的水溶液的比例为5∶95，保持二者的比例至3 min，然后在3 min～5 min内将二者的比例调整为95∶5，这一部分主要是洗脱样品中极性较强的杂质，5 min～10 min内将保持二者的比例为95∶5，这一部分主要是洗脱样品中目标化合物。通过上述两步梯度，在10 min内，可以较好的分离样品中多菌灵。图1为加标样品提取离子流图，从图1中可以看出多菌灵得到较好的分离。

图1 碰撞能量为20 eV时多菌灵的质谱图Fig.1 Mass spectrum of Carbendazim at the collision energy of 20 eV

图2 加标样品的抽取离子流图Fig.2 Extraction spectrum of Carbendazim of spiled sample

2.5 线性范围与检出限

将逐级稀释的标准工作液分别进样10 μL，测定结果经线性回归，线性范围：0.5μg/L～4000μg/L。回归方程（y为峰面积，Counts；x为浓度，ng/mL）y=414879.96x+40894.66；线性相关系数：0.9990。进空白样,以基线3倍噪声值在标准曲线查得结果计算，测得方法检出限为1.0μg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

每组准确称取空白样品4份，每份1.25 g，共2组，分别定量加入标准品，添加水平分别为0.2、1.0 mg/kg，按供试品溶液制备方法制备后进行测定,结果见表3。可以看出，不同浓度加标回收率85.0%～96.0%，相对标准偏差为3.71%。（n=8），满足试验要求。

表3 样品中加标回收率Table 3 Recovery of Carbendazim in spiled sample

3 结论

本文建立了茶叶中多菌灵残留的高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定方法。该法用0.2 mol/L盐酸甲醇溶液（1∶1，体积比）超声提取样品，OASIS MCX 固相萃取柱净化富集，C18反相色谱柱对样品中多菌灵进行有效分离，电喷雾离子化，串联质谱检测。实验表明：本法检出1.0μg/kg，加标回收率高于85.0%，达到了国内先进水平，完全满足国内外对茶叶中多菌灵残留检测限量要求。

[1]段云龙.NY 660-2003茶叶中甲萘威、丁硫克百威、多菌灵、残杀威和抗蚜威的最大残留限量[S].北京：中国标准出版社,2003:2-3

[2]吴刚,吴俭俭,赵珊红,等.加速溶剂萃取-固相萃取结合液相色谱分析茶叶中多菌灵残留量[J].中国食品学报,2008,8(4):165-168

[3]杨秀敏,陈永艳,胡彦学,等.固相微萃取-高效液相色谱-荧光检测法分析苹果汁中的多菌灵和噻菌灵[J].中国食品学报,2007,7(5):122-126