玉米超氧化物歧化酶的提取与纯化工艺

刘杰凤，张峰培，杜丽明

（广东石油化工学院生物工程系，广东 茂名 525000）

超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD;EC1.15.1.1)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子（O2－·）的歧化反应，使O2-·转化为H2O2和O2，是一种能清除体内超氧自由基的金属酶[1]。对SOD的生理功能研究表明，SOD具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎的作用，是一种新型的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景[2-4]。目前，SOD制品主要从动物血液或肝脏中获得，但是其应用存在安全性问题，而且杂蛋白含量高，人们正逐渐转向通过微生物发酵和从植物细胞中提取。已有的研究表明，有些植物的细胞质溶质及叶绿体中富含SOD，如芦荟、大蒜、玉米等[5-7]。尤其是玉米胚和胚乳中富含SOD，是一种具营养和保健作用的主要粮食作物，而且在我国广泛种植，产量高。在玉米的深加工前，如饲料复配、淀粉制备、乙醇发酵等，进行玉米SOD的提取，是提高玉米利用率，增加玉米深加工产品种类，深化玉米资源综合利用的有效途径。因此，工业化规模开发植物源SOD，玉米是最有潜力的资源之一。本文对玉米SOD提取工艺进行了优化试验，目的是找寻安全性能高、提取工艺简单、提取效率高、成本低的SOD生产工艺。

1 仪器、材料与方法

1.1 主要材料与试剂

糯玉米：茂名官渡市场购买；邻苯三酚(分析纯)、硫酸铵：天津市大茂化学试剂厂；考马斯亮蓝G-250、DEAE-纤维素、N-N’-亚甲基双丙烯酰胺：北京鼎国生物技术有限公司；标准牛血清白蛋白、丙烯酰胺（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

TU1810紫外-可见分光光度计：北京普通分析仪器厂；TGL-20M高速冷冻离心机：湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；PHS-3C酸度计：上海精密仪器有限公司；DYY-11型电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 玉米SOD的提取及纯化

1.3.1 SOD粗酶液的提取工艺

按一定料液比在100 g玉米中加入0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），28℃浸泡若干小时，淋干。匀浆机粉碎后，再以磷酸缓冲液30℃浸提1 h，4℃，5000 r/min离心15 min，得玉米SOD粗酶提取液，并对粗酶液进行分析。

1.3.2 沉淀分离

1.3.2.1 热变性

粗酶液于50℃～60℃水浴10 min～15 min，冷却，5000 r/min离心15 min，弃沉淀。

1.3.2.2 氯仿-乙醇混合液沉淀

取一定体积的粗酶液，加入0.25倍体积的冷氯仿-乙醇混合液（体积比为3∶5），冰水浴中搅拌15 min后，4℃，5000 r/min离心15 min，去除杂蛋白沉淀，上清液静置分层，弃下层液体，得上层酶液。

1.3.2.3 丙酮沉淀SOD

粗酶液置于冰浴中，缓慢加入4℃预冷的丙酮，搅拌10 min。5000 r/min、4℃冷冻离心15 min，弃上清，沉淀以50 mmol/L，pH7.8的磷酸缓冲液溶解。

1.3.3 DEAE-纤维素柱层析

粗产品用少量的磷酸缓冲液溶解后，通过预先经过pH7.8的2.5 mmol/L磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱（2.0 cm×30 cm），选用 2.5 mmol/L，pH7.8的起始缓冲液进行杂蛋白的洗脱，流速控制在1.2mL/min，直至没有杂蛋白为止（OD280nm吸光值低于0.1）（约1 h）。然后用2.5 mmol/L～50 mmol/L的pH7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，每管收集9 mL，收集40管，测定各管蛋白含量及酶活，合并活力峰。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳

柱层析纯化的酶液经冷丙酮沉淀，冷冻离心后，用磷酸缓冲液溶解，采用质量分数为10%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，加样量20 μL，用考马斯亮蓝R-250染色。

1.4 测定方法

1.4.1 蛋白质含量及紫外吸收光谱的测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法测定SOD蛋白浓度，以标准牛血清白蛋白绘制标准曲线，以A599为纵坐标，蛋白质含量（μg/mL）为横坐标作图，得回归方程为：y=0.0075x+0.0146，R2＝0.994。

采用TU1810紫外分光光度计对SOD进行光谱扫描（范围：200 nm～360 nm）。

1.4.2 酶活性的测定及酶活定义

改良的邻苯三酚自氧化法测定酶活[8]。酶活性单位采用1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速度达50%时的酶量定义为一个活力单位（U），以U/mL表示。

2 结果与讨论

2.1 玉米SOD粗酶液最佳提取条件的确定

2.1.1 SOD浸泡诱导和浸提过程磷酸缓冲液用量的选择

SOD在萌发的植物种子中含量最高，所以对种子进行浸泡诱导是获得SOD高收率的关键[8]。植物SOD多数为酸性酶，因而浸提常在中性或弱碱性体系中进行，常用的缓冲液有磷酸盐或Tris-HCl缓冲体系，本实验选用pH7.8、0.05 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（以下同）。固定玉米用量，分别改变浸泡和浸提的磷酸缓冲液用量，采用邻苯三酚法测定提取液中酶活力，考察了原料与磷酸盐缓冲液不同配比对SOD诱导及浸提效果的影响，结果见图1。

图1 磷酸缓冲液用量对SOD的诱导及浸提的影响Fig.1 Effect of phosphoric acid buffer solution dosage on induction and digestion of SOD

由图1可见，对SOD的浸泡诱导来说，缓冲液过少，浸泡不充分，浸泡液量过多，可能是由于氧的不足影响玉米呼吸从而使SOD活性降低，当玉米与磷酸缓冲液的配比为1∶1.5～1∶3时，均能得到较好的浸泡效果。而对于浸提来说，玉米与磷酸缓冲液的最佳配比为 1∶2（g/mL）。

2.1.2 诱导与浸提时间的确定

考察了不同浸泡诱导和浸提时间对SOD酶活力的影响，结果见图2。

图2 浸提时间对SOD酶活性的影响Fig.2 Effect of digestion time on SOD activity

由图2可见，最佳浸泡时间为25 h～30 h，这段时间为玉米种子开始萌发阶段，大量的SOD已合成，而最佳浸提取时间为1.5 h时，此时得到的SOD酶活力最高。

2.2 SOD沉淀分离工艺研究

SOD酶是金属酶，对热稳定性较高。在SOD的初步分离纯化中，常用热变性、氯仿-乙醇混合物或饱和度为50%以下的硫酸铵盐析等方法去除杂蛋白，而采用丙酮、聚乙二醇或饱和度为70%～90%的硫酸铵盐析法沉淀SOD。使用盐析法的最大优点是安全无毒，缺点是后续需增加透析除盐工艺，而且玉米中蛋白含量低，而SOD在水中的溶解度大，所用硫酸铵的量较大，而且沉淀分辩率较低。本实验采用丙酮沉淀SOD，比较了热变性与氯仿-乙醇混合物除杂蛋白对沉淀分离SOD效果的影响，不同的纯化方法及分离结果见表1。

表1 沉淀分离工艺对SOD纯化效果的影响Table 1 Effect of precipitation technology on purification of SOD

由表1可见，方法一除去了88%的杂蛋白，方法二除去了90%的杂蛋白，当变性温度升至60℃时，热变性除杂蛋白的效果将优于有机溶剂氯仿-乙醇沉淀法。当变性温度升至60℃时，热变性除杂蛋白的效果与有机溶剂氯仿-乙醇沉淀法相当。采用两次热变性沉淀杂蛋白，SOD的酶活力只损失6%，而总蛋白下降了17%，比酶活力提高了14%。可见，方法四是一种较好的纯化方法。

2.3 DEAE-纤维素离子交换柱层析

由纯化方法四所得沉淀用少量缓冲液溶解后，进行DEAE-纤维素柱层析，并测定层析收集到的40管酶液的蛋白质含量及酶活力，以试管编号为横坐标，吸光值为纵坐标作图，见图3。

图3 DEAE-纤维素纯化玉米SOD蛋白质及酶活力曲线Fig.3 The protein and activity curves of corn SOD by DEAE-cellulase column

由图3可见，在蛋白质分开的3峰中，第1个峰与SOD的活力峰基本重叠，即为玉米SOD的蛋白峰。磷酸缓冲液的浓度约为收集SOD活性峰出现的第11管至20管洗脱液，约为30mmol/L～40mmol/L。经DEAE-纤维素层析纯化后的酶活见表1。

2.4 玉米SOD的紫外吸收光谱

将经DEAE-纤维素离子交换柱分离纯化后的SOD磷酸缓冲液在紫外区（200 nm～340 nm）范围内进行吸收光谱扫描，结果见图4。

图4 玉米SOD的紫外吸收光谱Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of corn SOD

由于Cu·Zn-SOD含色氨酸或酪氨酸较少，而酪氨酸和色氨酸的最大吸收波长分别为275 nm和280 nm，所以SOD的紫外吸收特征有别于一般蛋白质。图4表明，玉米SOD在紫外区的最大吸收峰在260 nm处，这与文献报道的不同来源的Cu·Zn-SOD紫外吸收（255nm～270 nm）相一致[9]。

2.5 玉米SOD纯度的鉴定

采用SDS-PAGE电泳鉴定玉米SOD的纯度，将经上述各步分离所得蛋白质样品在同一凝胶上进行SDS-PAGE电泳，结果见图5。

图5 玉米SOD SDS-PAGE电泳谱图Fig.5 Picture of SDS-PAGE electrophoresis of corn SOD

由图5可见，随着分离的进行，蛋白条带越来越少，经DEAE-纤维素柱层析后，提取酶液只剩一条电泳带，Cu·Zn-SOD由两个分子量接近的亚基组成，说明纯化的玉米SOD己达到电泳纯。

3 结论

探讨了玉米超氧化物岐化酶（SOD）提取与纯化工艺条件，结果表明：一定量pH7.8、0.05 mol/L的磷酸缓冲液浸泡对玉米SOD的生成有一定的诱导作用，最佳诱导和浸提的原料与缓冲液配比分别为1∶1.5～1∶3、1∶2，最佳诱导和浸提时间分别为25 h～30 h和1.5 h。采用50、60℃两次热变性除杂蛋白，丙酮沉淀SOD得到的酶液纯度最好，比活力高，而且安全无毒。

沉淀分离的SOD酶经DEAE-纤维素柱层析纯化后，比酶活达到1699.7 U/mg，纯化倍数为30.7，酶的回收率为31%。SDS-PAGE电泳表明，纯化的玉米SOD己达电泳纯。

紫外光谱扫描结果表明，玉米SOD紫外区的吸收峰在260 nm处，而不在280 nm，表明其是含酪氨酸和色氨酸较少的Cu·Zn-SOD。

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