N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪肠道损伤的缓解作用

李 娇 伍国华 侯永清 王 蕾 丁斌鹰 朱惠玲 刘玉兰

(武汉工业学院动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023)

肠黏膜是营养物质消化和吸收的重要场所，同时也是防御肠道内微生物及致炎因子入侵的主要门户,维护肠黏膜的健康具有重要意义。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌外膜的主要致病成分，能诱导宿主细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)和活性氧族(ROS)等特异性致炎细胞因子,导致炎症的发生[1]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)为硫醇类化合物、巯基供给剂，在试验中及临床上都已得到广泛的应用[2]。NAC具有多种药理作用，它可以调节机体细胞凋亡程序，减少炎性细胞因子产生，清除自由基。研究表明，NAC可减轻辐射损伤相关肠屏障功能障碍(肠黏膜损伤、萎缩，肠通透性增加和内毒素异位等)[3]。还有研究发现，NAC能降低门静脉内毒素水平，改善梗阻性黄疸大鼠肠道屏障功能，有效减轻肠道黏膜的损伤[4]。但目前有关NAC的应用研究主要集中在医学领域或试验动物上，在动物科学领域的研究与应用报道很少。本试验采用脂多糖(LPS)刺激仔猪建立肠道受损模型，研究NAC对LPS刺激导致的肠道损伤是否具有缓解作用，为NAC的应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

N-乙酰半胱氨酸(NAC，市售医药级产品，纯度≥99.0%)、大肠杆菌脂多糖（LPS，大肠杆菌血清型055:B5，Sigma公司产品）。

1.2 试验动物与设计

选取24头来源一致健康仔猪 [杜洛克×长白×大白，体重（7.63±0.15）kg]，按单因子设计随机分配到4个处理组：①空白对照组、②LPS组、③0.025%NAC组、④0.05%NAC组。每个处理6个重复，每个重复1头猪。处理①和②组饲喂基础日粮，处理③和④组在基础日粮的基础上分别添加0.025%NAC和0.05%NAC。试验期为17 d。试验第17 d处理②、③、④组仔猪按照100 μg/kg BW的剂量腹膜注射LPS，处理①组注射等量的生理盐水。注射LPS或生理盐水6 h后，仔猪注射50 mg/kg BW戊巴比妥钠，待完全麻醉后屠宰。

1.3 试验日粮

基础日粮配制参照NRC（1998）猪的营养需要（8～20 kg），日粮的组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.4 饲养管理

试验期间猪舍温度保持在22～25℃。在不锈钢代谢笼中饲养试验猪，鸭嘴式饮水器自动供水，自由采食，猪舍定期清扫和消毒。

1.5 肠道样品采集及处理

仔猪屠宰后剖开腹腔取十二指肠、空肠和回肠，将三段肠从其肠系膜处取下并立即置于冰上。十二指肠是取胃和胆管在小肠开口处之间的部分，组织取样距胃贲门5 cm处；空肠是十二指肠和回肠间的部分，于空肠的1/2处取样；回肠是回盲瓣和结肠间的部分，于回肠的1/2处取样，所取肠段均为10 cm左右。用剪刀轻轻剖开肠段，并用冷冻生理盐水轻轻冲洗肠壁内容物，用滤纸吸干水分，而后用载玻片刮取肠黏膜[5]，分装在无菌的冻存管中，并立即在液氮中冷冻，再转移至-80℃超低温冰箱中保存待测。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 小肠黏膜蛋白（TP）、DNA和RNA的含量

肠黏膜匀浆后，3 000 r/min离心10 min，取上清液，再稀释到浓度为1%，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[6]。DNA浓度用紫外可见分光光度法[7]测定。RNA浓度通过测定232 nm和260 nm处的吸光度值，用F1eck-Begg[8]公式算出。 DNA、RNA和蛋白质浓度分别乘以黏膜重量即为DNA、RNA和蛋白质在肠黏膜中的总量。

1.6.2 小肠黏膜二糖酶活性

十二指肠、空肠和回肠黏膜称重后，用冰冻的生理盐水稀释（10∶1，v/w），再用匀浆器冰上匀浆，14 000 r/min离心15 min，取上清液，采用酶偶联法（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法）测定[9]。

酶活力单位定义：37℃下每分钟分解1.0 μmol/l底物为1个酶活力单位，单位为μmol底物/min或U。

二糖酶活力＝X×n/60×a

式中：X——反式所释放的葡萄糖（μmol/l）；

a——二糖中葡萄糖释放量，麦芽糖为2，蔗糖和乳糖为1；

n——样品稀释倍数；

60——反应时间（min）。

1.6.3 空肠黏膜occludin蛋白相对表达量

采用Western blot方法测定。取约0.1 g空肠黏膜,加入0.5～1 ml冷Lysis Buffer(凯基全蛋白提取试剂盒),匀浆，在 12 000 ×g、4 ℃下离心 15 min,上清液即为全蛋白提取物。然后用考马斯亮蓝染色法测量吸光度,求出总蛋白浓度,根据此浓度配成等蛋白浓度溶液。用2×SDS上样缓冲液按1∶1稀释待测蛋白样品,于100℃煮沸5 min,然后垂直电泳分离。分离胶浓度10%,电泳结束后,半干法转膜至PVDF膜上,室温5%脱脂奶粉封闭1 h,洗膜后孵occludin(Invitrogen公司)和β-actin,4℃过夜,洗膜后孵二抗,室温下孵育1.5 h。再次洗膜后用ECL发光试剂（Pierce公司）显影，用Alpha Innotech成像系统软件分析occludin蛋白相对表达量,结果以occludin蛋白与内参的灰度比值表示。

1.7 数据分析

试验数据采用 SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's法多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 NAC对LPS刺激仔猪小肠黏膜细胞生长的影响

小肠各段DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值结果见表2。

表2 NAC对LPS刺激仔猪小肠DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值的影响

由表2可知，与空白的对照组相比，LPS组空肠黏膜的DNA含量显著下降（P＜0.05）；空肠黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均显著提高（P＜0.05）。与LPS组相比，0.025%NAC组空肠黏膜的DNA含量显著提高（P＜0.05），RNA/DNA 比值显著降低（P＜0.05）；0.05%NAC组空肠黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均显著降低（P＜0.05）。其他各项检测指标差异不显著（P＞0.05）。

2.2 NAC对LPS刺激仔猪小肠黏膜二糖酶活性的影响（见表 3）

表3 NAC对LPS刺激仔猪小肠黏膜二糖酶活性的影响（U/mg prot.）（n=6）

由表3可知，与空白对照组相比，LPS组空肠麦芽糖酶、十二指肠和空肠乳糖酶活性显著下降（P＜0.05）。与LPS组相比，0.025%NAC组十二指肠乳糖酶活性显著提高（P＜0.05）；0.05%NAC组空肠麦芽糖酶、十二指肠和空肠乳糖酶活性均显著提高（P＜0.05）。其他指标差异不显著（P＞0.05）。

2.3 NAC对LPS刺激仔猪空肠黏膜occludin相对表达量的影响（见图1）

图1 NAC对LPS刺激仔猪空肠黏膜occludin相对表达量的影响

由图1可知，与空白对照组相比，LPS组空肠黏膜occludin相对表达量显著降低（P＜0.05）。与LPS组相比，0.025%NAC组和0.05%NAC组空肠黏膜occludin相对表达量显著提高（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 添加NAC对LPS刺激仔猪小肠黏膜细胞生长的影响

肠黏膜细胞生长的本质是细胞数目的增加和细胞体积的增大。DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值可以作为肠黏膜细胞生长发育的生化指标。DNA含量是细胞数量增加的指标，RNA含量的增大通常意味着蛋白质合成的增加。RNA/DNA比值能比较准确反映细胞大小增加的情况[10]。TP/DNA比值可作为衡量细胞肥大程度的指标，反映细胞的大小[11]。

LPS刺激能降低空肠黏膜DNA含量，这与张伟[12]的研究结果类似。而添加NAC后DNA含量明显提高，这说明NAC对LPS刺激导致的肠黏膜细胞数量减少有缓解作用，进而对肠黏膜产生了保护作用。其作用机制可能是抑制过氧化物造成的DNA断裂和化学诱导的细胞转化，增强DNA甲基转移酶活性，修复受损的DNA[13]。NAC的这种修复作用可以保护细胞免于DNA损伤引起的死亡[14]。试验结果还发现，LPS刺激后，导致空肠黏膜RNA/DNA、TP/DNA比值提高，NAC能使比值降低，这可能是因为处于应激状态下，肠黏膜细胞在受损时，表现为细胞的活性增强，病理性肿胀，单个细胞的生长效率加快，代偿性代谢旺盛，负荷过重所致，添加NAC能较好地缓解这种病理性变化。

3.2 添加NAC对LPS刺激仔猪小肠黏膜二糖酶活性的影响

在动物体内，碳水化合物消化吸收的关键酶是小肠二糖酶。二糖酶是小肠绒毛刷状缘上的主要蛋白质[15]，小肠黏膜上皮细胞的数量始终处于一个动态变化的过程中，二糖酶就是来自脱落的肠黏膜上皮细胞，细胞脱落崩解后释放二糖酶。二糖酶活性大小可衡量肠道黏膜上皮细胞发育程度和功能强弱[16]。多糖和寡糖需先在消化酶的作用下形成二糖，再经二糖酶分解成单糖后才能被吸收[17]。本试验结果表明，日粮中添加NAC对LPS刺激导致十二指肠乳糖酶、空肠麦芽糖酶和乳糖酶活性的降低有一定的缓解作用。研究表明，LPS刺激宿主细胞表达活性氧族（ROS）等细胞因子，ROS作为NADPH氧化酶产生的第二信使参与炎症反应[18]。NAC可以抑制细胞中NADPH氧化酶活性，进而抑制LPS刺激细胞因子（TNF-α和ROS）的表达，阻断LPS的作用通路，从而使小肠黏膜细胞不断更新，二糖酶的分泌释放恢复正常。

3.3 添加NAC对LPS刺激仔猪空肠黏膜occludin相对表达量的影响

内毒素通过肠黏膜的主要途径是经肠黏膜细胞间紧密连接直接透过细胞膜，而位于肠上皮的紧密连接对维持肠黏膜的屏障功能至关重要[19]，occludin是细胞间紧密连接的特征性蛋白，可以直接反映紧密连接的结构和功能的完整性。有研究发现，occludin蛋白对维持肠黏膜屏障功能起至关重要的作用，其表达可改变肠黏膜通透性[20]。体外研究试验证实，TNF-α能降解紧密连接蛋白[21-22]，抑制occludin的表达[23]，增加肠道上皮细胞的通透性。

在本试验中，日粮中添加NAC缓解了LPS刺激导致的空肠黏膜细胞间occludin表达下降，这与本实验室前期研究结果一致[24]，说明NAC可能通过抑制LPS引起的细胞因子TNF-α的表达，促进occludin的表达，进而修复细胞间紧密连接，改善肠道屏障功能、缓解肠道损伤。

4 结论

LPS刺激损伤仔猪肠道黏膜，导致DNA含量减少、二糖酶活性降低和occludin表达量降低，日粮中添加0.025%或0.05%NAC对LPS刺激所导致的肠道损伤有缓解作用。