氯沙坦钾胶囊及其片剂在健康人体的生物等效性研究

王淑民，武 峰，周 辉，郭韶洁，赵秀丽，李鹏飞，刘丽宏，耿玉先（. 首都医科大学附属北京同仁医院国家药物临床试验机构，北京 0070；. 第二炮兵总医院药剂科，北京 00088；. 北京万生药业有限责任公司，北京 0）

氯沙坦钾是一种长效、高效、低毒的新型AT1拮抗剂，用于治疗原发性高血压。对大多数患者，通常起始和维持剂量为每天50 mg。其口服吸收后形成羧酸型活性代谢产物E-3174及其他无活性代谢产物。

氯沙坦及主要代谢产物E-3174的检测最早有液相色谱紫外法及荧光法等[1]，但这些方法灵敏度低，需要血浆样本量大，制备过程相对复杂，需要较长的分析时间。本试验首次建立了采用甲醇直接沉淀方法处理血浆样品，样品无需浓缩，应用LC-MS/MS同时定量血浆中氯沙坦原型及其活性代谢产物E-3174，该方法比文献[2-4]报道的方法前处理过程简单，分析时间短，快速检测，可成功地运用于氯沙坦钾片的人体药动学和生物等效性研究。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

试验制剂：氯沙坦钾胶囊（北京万生药业有限责任公司，规格50 mg/粒，批号20090501）。参比制剂：氯沙坦钾片（杭州默沙东制药有限公司，规格50 mg/片，批号09427）。

氯沙坦钾对照品（中国药品生物制品检定所，纯度100%，批号100597-200501）。E-3174对照品（Philip Chan公司，纯度98.7%，批号L470510）。替米沙坦对照品（广州清平制药有限公司，含量99.8%，批号M060601）。

甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，空白人血浆由解放军二炮总医院Ⅰ期临床试验研究室提供。

3200 QTrap型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.4.2 数据处理软件（美国Applied Biosystems公司）；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，切换阀（美国Agilent公司）。

1.2 受试者选择

本试验共入选20名健康男性受试者，年龄27 ～35岁，平均（31±3.13）岁，身高161 ～ 180 cm，平均（170±6.16） cm，体重50 ～ 77 kg，平均（63.45±8.20）kg，体重指数19 ～ 24。20名受试者的年龄、身高、体重、血压、心率、呼吸、体温，实验室检查等各项指标测定值均在正常范围内，心电图及胸片检查结果均正常。无伴随疾病和药物过敏史，精神状况良好，无烟酒等不良嗜好，试验前2周未服用任何药物，试验期间禁服其他药物及烟、酒、茶等。受试者试验前充分了解试验目的、试验内容及可能出现的不良反应，自愿签署知情同意书。试验经首都医科大学附属北京同仁医院医学伦理委员会批准。

1.3 给药方案与血样采集

按两周期交叉自身对照试验设计，20名健康成年男性受试者随机分为2组，分别交叉口服试验制剂或参比制剂50 mg，2次给药间隔清洗期为1周。受试者于给药前一天入住I期病房，隔夜禁食不禁水10 h以上，试验于早晨8:00开始，按规定剂量口服试验药物。分别于服药前，服药后0.17、0.33、0.67、1、1.33、1.67、2、3、4、5、6、8、12、24、36 h于受试者上肢肘窝静脉取血4 mL，血样立即放置肝素化离心管，3500 r·min-1离心10 min，血浆置– 40 ℃冰箱保存待测。

1.4 分析条件

色谱条件：色谱柱：Kromasil C18柱（50 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-1 mmol·L-1乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）（78∶22）；流速：1.1 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

质谱条件：离子源：离子喷雾离子化源正离子模式；离子喷射电压：5500 V；温度：580 ℃；源内气体1（GS1，N2）压力：48 psi；气体2（GS2，N2）压力：55 psi；气帘气体（N2）压力：25 psi；扫描方式为多重反应监测（MRM）；碰撞气（N2）压力：Medium；氯沙坦、E-3174、替米沙坦解簇电压（DP）分别为：30 V、22 V、35 V；碰撞能量（CE）分别为：32 eV、32 eV、50 eV；氯沙坦、E-3174、替米沙坦用于定量分析的离子反应分别为m/z 423.4→206.9、m/z 437.4→207.4和 m/z 515.1→276.1，氯沙坦、E-3174用于定性考察的离子对分别为m/z 423.4→405.4、m/z 437.4→235.4。

1.5 血浆样品处理

精密取血浆样品100 μL置1.5 mL EP管中，加入甲醇溶液100 μL，加入内标溶液300 μL，涡旋30 s、离心5 min（13 200 r·min-1），取100 μL进行LC-MS/MS分析，进样量20 μL。

1.6 专属性实验

专属性实验结果见图1。

图1 LC-MS/MS测定人血浆中氯沙坦、E-3174和内标替米沙坦的典型MRM色谱图A – 空白血浆；B – 空白血浆中氯沙坦（3.0 ng·mL-1）、E-3174（3.0 ng·mL-1）、内标替米沙坦（5.0 ng·mL-1）；C – 受试者口服氯沙坦胶囊后1 h的血浆样品；Ⅰ– 氯沙坦；Ⅱ– E-3174；Ⅲ– 替米沙坦（内标）Fig 1 Representive MRM chromatograms of losartan and E-3174 and temisartan (internal standard)A – blank plasma; B – blank plasma spiked with losartan and E-3174 and temisartan; C – 1 h plasma sample from one subject given a single dose of test losartan capsule; Ⅰ– losartan; Ⅱ– E-3174; Ⅲ –temisartan

1.7 标准曲线和定量限

取100 μL空白血浆，置1.5 mL EP管中，分别加入100 μL标准曲线溶液和300 μL内标溶液，涡旋30 s，离心5 min（13 200 r·min-1），进样20 μL，进行LC-MS/MS分析。每个浓度3样本，连续3 d，以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W = 1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得回归方程。氯沙坦的回归方程为：y = 0.024 8x+ 0.010 6（r = 0.994 5），E-3174的回归方程为：y =0.004 91x + 0.014 3（r = 0.996 8）。氯沙坦和E-3174的定量下限均为3 μg·L-1。

1.8 精密度和回收率实验

按“1.7”项下操作, 制备低、中、高3个浓度（氯沙坦和E-3174的浓度均为10.0、100.0、800.0 μg·L-1）的质量控制（QC）样品，每浓度6样本，连续测定3 d。根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度。氯沙坦的低、中、高3个浓度的日内和日间变异系数分别是6.31%、7.33%、7.92%和17.04%、6.46%、11.67%；E-3174的低、中、高3个浓度的日内和日间变异系数分别是6.97%、6.29%、5.47%和11.89%、8.17%、10.38%。

1.9 提取回收率实验和基质效应

取空白血浆100 μL，按“1.7”项下操作，制备低、中、高3个浓度的样本（氯沙坦和E-3174的浓度均为10.0、100.0、800.0 μg·L-1），每浓度3样本。同时另取空白血浆100 μL，加入甲醇（沉淀剂）100 μL，乙腈300 μL，涡旋30 s，离心5 min（13 200 r·min-1），上清液转移至1.5 mL EP 管中45 ℃吹干，加入相应浓度的标准溶液100 μL，内标300 μL，涡旋30 s，取样150 μL，进样20 μL进行LC-MS/MS分析，获得相应峰面积，以每一浓度两种处理方法测得峰面积比值计算提取回收率，氯沙坦低、中、高3个浓度提取回收率分别为：（96.2±5.9）%、（93.6±5.6%）、（96.2%±5.7）%；E-3174低、中、高3个浓度提取回收率分别为：（96.4±6.0）%、（90.8±5.6）%、（98.4±5.6）%；内标替米沙坦的提取回收率为（94.3±5.2）%。以蒸馏水代替空白血浆，进行上述操作制作基质效应考察样本。以每一浓度两种处理方法测得浓度比值计算基质效应，氯沙坦和E-3174低、中、高3个浓度基质效应分别为1.56%和– 0.25%，内标基质效应为– 1.58%。结果显示：血样中氯沙坦、E-3174和替米沙坦的提取回收率均较高且稳定，血样中基质对氯沙坦、E-3174和替米沙坦的基质效应均较小（＜ 2%），不影响准确测定。

1.1 0 稳定性实验

配制氯沙坦和E-3174低、中、高3个浓度稳定性QC样品，每浓度3样本，按“1.5”项下操作，测定浓度，进行冰冻放置40 d、3次冰冻融溶、室温放置16 h稳定性实验。结果显示，所有长期稳定性实验测定值与添加值的相对偏差（RE）均小于15%，表明冰冻放置血浆样品、3次冰冻融溶、16 h室温放置血浆样品不影响本方法对样品浓度进行准确测定。

1.1 1 统计学处理

采用DAS2.0软件计算主要药代动力学参数及进行生物等效性统计学分析，Cmax、tmax采用实测值，AUC采用梯形法计算。AUC及Cmax经对数转换后进行方差分析、双单侧t检验及90%置信区间计算；tmax采用非参数法统计。

2 结果

2.1 血药浓度-时间曲线

19名健康受试者交叉服用试验制剂及参比制剂后，氯沙坦和E-3174的平均血药浓度－时间曲线变化趋势基本一致，具体见图2、图3。

图2 受试者口服氯沙坦钾试验制剂和参比制剂后血浆中氯沙坦的平均药时曲线. n = 19Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of losartan after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19

图3 受试者口服氯沙坦钾试验制剂和参比制剂后血浆中E-3174的平均药时曲线. n = 19Fig 3 Mean plasma concentration-time curve of E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19

2.2 药代动力学参数及生物等效性

氯沙坦和E-3174的主要药动学参数见表1，经统计分析，各参数在试验和参比制剂间差异无显著性（P ＞ 0.05）。氯沙坦和E-3174的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞经对数转换后进行方差分析和双单侧t检验，2种制剂及给药周期间差异均无显著性（P ＞ 0.05）。90%置信区间的计算结果，Cmax分别为89.9% ～ 125.3%和94.1% ～114.7%，落在参比制剂的80% ～ 125%范围内。AUC0-t分别为94.6% ～ 111.8%和99.7% ～ 109.5%，AUC0-t分别为93.5% ～ 110.0%和99.7% ～ 109.3%，均落在参比制剂的70% ～ 143%范围内。参数Cmax、AUC0-t及AUC0-∞经对数转换后进行方差分析和双单侧t检验，2种制剂及给药周期间差异均无显著性（P ＞ 0.05）。两种制剂的tmax经非参数检验无显著性（P ＞ 0.05）。因此，试验制剂与参比制剂具有生物等效性。

表1 健康受试者单次口服氯沙坦钾试验制剂和参比制剂的主要药动学参数. n = 19, ±sTab 1 Main pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19, ±s

表1 健康受试者单次口服氯沙坦钾试验制剂和参比制剂的主要药动学参数. n = 19, ±sTab 1 Main pharmacokinetic parameters of losartan and E-3174 after oral administration of test and reference preparation in healthy volunteers. n = 19, ±s

E-3174试验制剂 参比制剂 试验制剂 参比制剂t1/2/h 1.84±0.52 1.99±0.60 4.17±0.49 4.13±0.66 tmax/h 0.70±0.22 0.98±0.62 3.14±0.72 3.39±0.96 Cmax/μg·L-1 183.8±91.30 176.45±93.97 344.85±114.33 329.95±106.42 AUC0-t/μg·h·L-1 333.18±105.00 323.75±101.92 2 445.09±608.97 2 332.54±564.72 AUC0-∞/μg·h·L-1 344.88±104.15 341.32±106.13 2 503.45±612.62 2 390.92±567.03 AUC0-t/AUC0-∞ 0.96±0.03 0.95±0.03 0.98±0.01 0.98±0.01参数 氯沙坦

2.3 安全性评价

通过受试者自发报告或由医师观察发现的不良事件，以及实验室检查异常，评价药物的临床安全性。同时，试验期间以非诱导的方式询问受试者可能有关的不良事件。共有19名受试者进入研究，在试验期间，未发生严重不良事件。受试者均未出现有临床意义的生命体征的改变和自诉不适及临床症状。给药后实验室检查发生异常，有5人次共6例，其中5例TG、1例TC升高，7 d后复查实验室结果均恢复正常，经研究者判断与试验药物的相关性为可能无关。研究者认为可能是一些受试者在试验期间，活动减少，日常饮食改变等因素导致TG、TC一过性升高。

3 讨论

氯沙坦是一种血管紧张素Ⅱ（AT1)受体拮抗药，临床上广泛用于治疗高血压病和充血性心衰。体内体外研究表明，氯沙坦主要是由CYP2C9介导代谢转化的。在7种代谢产物中，5-羟代谢产物E-3174具有比母药更强的药理活性，为氯沙坦药物降压作用主要来源。E-3174药代动力学特性与母药比较，t1/2更长和AUC更大[5]。研究结果表明，氯沙坦血浆浓度下降很快，8 h后几乎降至检测限以下。氯沙坦在体内约有14%转化为E-3174,但是E-3174在血浆中的浓度和AUC远远高于氯沙坦，这是由于E-3174的清除率比氯沙坦的清除率低很多[6]。

LC-MS/MS检测血浆样品过程中，14号受试者在第Ⅱ周期，无法检测到氯沙坦和E-3174浓度。经查询原始记录，14号受试者服用的是参比制剂，有该受试者给药剂量及给药时间记录及所有血样品采集记录。因为参比制剂是市售制剂，并且只有1例受试者出现未检测出血浆浓度，经研究者讨论，认为很可能是该受试者自行未服药，此受试者作为剔除病例。故入选了20例受试者，但19人参与了数据统计。

吕承哲等[7]在其生物等效性文章中认为氯沙坦在体中的代谢有很强的个体特异性，CYP2C9*2和CYP2C9*3型突变会导致氯沙坦药效降低，建议在临床用药过程中，具有CYP2C9*2 和CYP2C9*3等位基因的个体需加大氯沙坦用量或放弃选用氯沙坦降压治疗。在本研究中，氯沙坦在试验制剂和参比制剂Cmax的CV%分别为49.7%和53.3%，E-3174分别为33.2%和32.3%。其中几个受试者的Cmax低于其他人，这可能与基因多态性有关。