不同种类食物中葛根素含量的测定

刘阳，韦京豫，蒲玲玲，吴健全，杨继军，郭长江

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050）

葛根素（puerarin）是从豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根中提取出来的一种异黄酮成分,其化学名称为7，4’-二羟基异黄酮-8β-D-葡萄吡喃糖，呈白色针状结晶，能溶于水，但溶解度小，其水溶液为无色或微黄色。它具有改善心脑血管循环、降低血糖、防止高血压及动脉硬化、提高机体免疫力、抗菌、抗病毒等多种药理作用，并具有明显的解酒和改善学习记忆功效[1-4]。葛根素因毒性小,安全范围广,疗效好而极具临床应用价值。它常见的测定方法有：紫外分光光度法（UV）[5]、高效液相色谱法（HPLC）[6]、薄层色谱法（TLC）[7]和毛细管电泳（CE）[8]等。但应用范围最广的是HPLC,本实验采用HPLC方法测定不同种类食物中葛根素的含量，进一步了解葛根素在不同种属植物中的分布情况。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

葛根素标准品(中国药品生物制品检定所)。主要仪器包括2695型高效液相色谱仪、2998型二极管阵列检测器：Waters公司；ALPHA1-4/LD-2型冷冻干燥机：德国Martin Christ公司。

1.2 样品采集与处理

1.2.1 样品采集

共采集60种食物样品，分别由重庆、广州、天津、武汉4个不同地区提供，主要包括蔬菜、水果及干豆类食物。蔬菜水果样品用自来水、蒸馏水反复冲洗干净，晾干，按我国居民食用习惯将可食用部分（不少于300 g）切成丁块并混合均匀，冷冻干燥24 h后取出，分装入铝箔袋中，抽真空后封口，放入-50℃低温冰箱中保存，同时测算每种样品的水分含量。干豆类样品直接用打碎机研成粉末，分装入铝箔袋中，抽真空后保存备用。

1.2.2 样品前处理

分别取食物样品，将其研制成粉末，精密称取0.25 g，置于容量为50 mL的离心管内，加入水-甲醇（1∶1）混合液20 mL，置于85℃水浴30 min，冷却后3000 r/min离心10 min，将上清液移置50 mL容量瓶中，残渣再用水-甲醇（1∶1）混合液提取两次，每次加入 15 mL，涡旋震荡3 min，离心分离，将其上清液并入上述容量瓶中，加水-甲醇（1∶1）混合液至刻度线，作为样品溶液。每种食物样品平行取样处理测定3次。

1.2.3 标准溶液的制备

精确称取葛根素对照品 5 mg，加水-甲醇（1∶1）混合液溶解后配制成10 mL储存溶液。准确量取该液1 mL，置入 25 mL 容量瓶中，加水-甲醇（1∶1）混合液至刻度，作为标准品应用液。

1.3 色谱条件

方法[9]，结合本实验室条件确定如下：色谱柱：Waters Nova-Pak C18（4μm,3.9 mm×150 mm）；流动相：水-乙腈-磷酸（900∶100∶1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35℃；测定时取10μL进样，按上述色谱条件进行分析，测定各溶液中葛根素的峰面积，并由此计算出样品中葛根素的含量，测定结果（以干重计）以mg/100 g（dry weight,DW）表示。

2 结果

2.1 葛根素色谱峰的定性

分别取葛根素标准品溶液和葛根样品溶液，按上述色谱条件进样分析，结果显示，标准葛根素的保留时间为6.2 min左右，将葛根素标准品与葛根样品的HPLC图谱进行叠加，如图1。

图1 葛根素标准品与葛根样品HPLC图谱叠加Fig.1 HPLC chromatogram map overlay of puerarin radix puerariae sample

样品中葛根素的出峰时间与其完全吻合，表明样品中葛根素得到很好的分离，色谱峰形佳，干扰峰少且无拖尾现象。

2.2 标准曲线的建立

取葛根素标准品适量，精密称定，加水-甲醇（1∶1）混合液溶解后，配制成浓度为 3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL的溶液，分别取上述溶液各10μL进样，在上述色谱条件下分析，记录色谱峰面积，在3.125μg/mL～100μg/mL的浓度范围内，色谱峰面积与葛根素浓度呈良好的线性关系，见图2。回归方程为y=39796x-5306.9，R2=0.9998。

图2 葛根素标准曲线Fig.2 The standard curve of puerarin

2.3 样品含量的测定

2.3.1 葛根中葛根素含量的测定

按照样品前处理方法配制葛根样品溶液，取10μL进样，平行测定3次，按外标法以峰面积计算葛根素含量。经测定，产自天津的葛根样品中葛根素含量（以干重计）为（170.30±1.13）mg/100 g。

2.3.2 蔬菜中葛根素含量的测定

共测定了采集于不同地区的40种蔬菜样品，包括鲜豌豆、蜜豆、花豆角、刀豆、四季豆、豌豆苗、黄豆苗、藕、红薯、粉莲藕、红心番薯、紫甘薯、红甘薯、南瓜、生姜、豇豆、扁豆、毛豆、荷兰豆、绿豆芽、黄豆芽、芋头、山药、土豆、白萝卜等。测定结果显示，只在6种蔬菜中检出葛根素，其余样品均未检出。其中芋头中葛根素含量最高，为18.60 mg/100 g（以干重计），远高于其它蔬菜；重庆地区共有4种蔬菜检出葛根素，而武汉地区蔬菜样品均未检出。不同地区绿豆芽中均检出葛根素，其中广州地区绿豆芽中葛根素含量（以干重计）为0.79 mg/100 g，而重庆地区绿豆芽中葛根素含量（以干重计）为 0.58 mg/100 g（表 1）。

表1 不同地区蔬菜（干重）中葛根素含量(mg/100 g，，n=3)Table 1 Puerarin content in vegetables from different areas

表1 不同地区蔬菜（干重）中葛根素含量(mg/100 g，，n=3)Table 1 Puerarin content in vegetables from different areas

2.3.3 水果中葛根素含量的测定

共检测了10种水果样品，包括苹果、梨、脐橙、西瓜、水蜜桃、草莓、芒果、猕猴桃、香蕉、巨峰葡萄，但只在重庆芒果中检出葛根素，含量（以干重计）为（0.97±0.09）mg/100 g。说明葛根素在水果中分布较少，含量也偏低。

2.3.4 干豆类食物中葛根素含量的测定

共测定了10种干豆类食物样品，包括花豆、黄豆、绿豆、青豆、蚕豆、豌豆、黑豆、白芸豆、红芸豆、赤小豆。结果显示，葛根素在干豆类食物中分布也较少，只在天津绿豆中检出葛根素，含量（以干重计）为（1.99±0.07）mg/100 g。

3 结论

根据《中国药典》2005年版，关于葛根药材中葛根素的含量测定方法是以甲醇-水（25∶75）作为流动相[10]，其葛根素的吸收峰与随后的小杂峰的分离效果不好,出现尖峰还有拖尾现象，且出峰时间较晚[11]。本实验参考文献方法[9]，流动相采用水-乙腈-磷酸（900∶100∶1）体系，结果在此条件下葛根素峰形尖锐且对称，原因可能是葛根素含有酚羟基，容易解离，加入酸可以抑制酚羟基的解离，也有效防止了拖尾现象。本实验方法操作简便，可应用于食物或中药材中葛根素含量的测定。

以往文献多是对中药材及饮片中葛根素含量的报道，而未见对食物中葛根素含量测定的报道，本研究丰富了这方面的数据。实验结果显示，除葛根中含有丰富的葛根素外，一些食物中也含有一定量的葛根素，如芋头，含量（以干重计）达18.60 mg/100 g，远高于其它样品；广州、重庆地区绿豆芽均检出葛根素，含量（以干重计）范围在0.58 mg/100 g～0.79 mg/100 g。水果样品只在芒果中检出葛根素，含量（以干重计）为0.97 mg/100 g。干豆类样品也只在绿豆中检出葛根素，含量（以干重计）为1.99 mg/100 g。总体上看，葛根素在不同种类食物中分布范围不广，主要分布在豆科类植物中，且含量也普遍较低。

参考文献：

[1]Lamlertkittikul S,Chandeying V.Efficacy and safety of Pueraria mirifica(Kwao Kruea Khao)for the treatment of vasomotor symptoms in perimenopausal women:phase II study[J].J Med Assoc Thai,2004,87:33-40

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[4]孙长颢.营养与食品卫生学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2007:110-121

[5]中华人民共和国卫生部药品标准(试行)[S].WS-257(X-207)-92[6]颜军,胡静,陈启蒙.HPLC法测定注射用葛根素中葛根素含量[J].天津药学,2008,20(4):26-28

[7]李云霞.薄层扫描法测定葛根药材中葛根素含量[J].中成药,2001,23(6):444

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[9]王慕邹.常用中草药高效液相色谱分析[M].北京:科学出版社,1999:354-357

[10]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(2005年版一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:233-234

[11]阮洪生.高效液相色谱法测定葛根素注射液中葛根素的含量[J].现代中药研究与实践,2006,20(4):46-47