超声波法提取珍珠香菇多糖的工艺研究

魏海香，梁宝东

（济宁学院生命科学与工程系，山东 曲阜 273155）

香菇是世界第二大食用菌，它含有的多糖是一种特殊的免疫调节剂，在激活T淋巴细胞中具有强烈的宿主介导性，能刺激抗体形成，增强人体免疫力，发挥抗癌作用[1]。这种作用越来越受到人们的重视。目前，香菇多糖的提取方法有很多种，比如水浸提取法、酶提取、碱提法等。这些方法在提取香菇多糖上都有积极的意义，但具有费时长、耗能高、提取效率较低等缺点，这都是亟待我们解决的问题。近年来，随着新型的科学技术不断投入到多种物质的提取中，超声波技术在植物生物碱、苷类、生物活性物质等提取中的应用较多[2-4]。本试验立足于当前珍珠香菇多糖提取的实际情况，以提高产率，降低成本为目的，采用新型的科学技术超声波法提取珍珠香菇多糖，并确定最佳的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

珍珠香菇：实验基地采收，个体大小匀称，质量较好。

1.2 仪器、设备

JY92-2D超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SY2-4电热恒温水浴锅：北京市医疗设备厂；KEO-JD 201微电脑电磁炉：康佳集团股份有限公司；TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；722N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；FW-100高速万能粉碎机：北京市用光明医疗仪器厂；Ro（NaF－40）-UF-4010 实验用膜分离超滤装置：上海亚东核级树脂有限公司。

1.3 药品与试剂

葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、无水氢氧化钠、丙三醇均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 珍珠香菇多糖的提取工艺

干珍珠香菇→粉碎→水提取→离心→超滤→多糖提取液

1.4.2 绘制标准曲线

用电子天平准确称取0.5 g无水葡萄糖，待溶解后定容至500 mL，即1 mg/mL葡萄糖标准液。准确吸取1 mg/mL 的葡萄糖标准液 0、1、2、3、4、5、6、7、8 mL 分别加入到50 mL的容量瓶中，各加5 mL的DNS，沸水浴5 min，流水迅速冷却，定容摇匀，空白调零。静置20 min，在540 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of dextrose

1.4.3 珍珠香菇多糖的测定3，5-二硝基水杨酸法[5]。

1.4.4 珍珠香菇多糖的提取率

珍珠香菇多糖浓度/%=（OD样品-0.024）/3.8883

珍珠香菇多糖提取率/%=[（珍珠香菇多糖浓度×N×V）/M]×100%

式中：OD样品为样品在540 nm的吸光度；N为稀释倍数；V为提取液体积，mL；M为原料干重，g。

2 结果与分析

2.1 珍珠香菇多糖提取单因素试验

2.1.1 不同料液比对珍珠香菇多糖提取效果的影响

准确称取1.0000g珍珠香菇粉末，分别加入10、15、20、25、30 mL 的蒸馏水，经过料液比为 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的不同处理，设定超声提取时间 60 min、提取温度60℃、超声波功率160 W，处理后，用离心机将样品以3500 r/min的转速离心10 min，取上清液进行超滤，然后用3，5-二硝基水杨酸法测定提取液的珍珠香菇多糖提取率，结果见图2。

图2 料液比对珍珠香菇多糖提取率的影响Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on extration ratio of pearl lentinan

由图2可知，珍珠香菇多糖的得率随着液料比的变化而改变。在一定范围内，随着液料比的增大，测得的珍珠香菇多糖提取率不断增大。吸光度越高，主要是因为溶剂与珍珠香菇粉末充分接触，在相同时间内水溶性珍珠香菇多糖溶出量增加，故提取率逐渐增大。当液料比大于25∶1（mL/g）时，曲线反而有所降低，说明多糖溶解基本饱和。如果液料比过小，未充分溶出，从而使得率降低；如果液料比过大，消耗的能量和时间会更多，同时也会减小超声波破碎细胞的能力，使细胞破碎程度下降，从而降低有效成分的得率[6]，因此液料比为 25∶1（mL/g）较适宜。

2.1.2 不同超声时间对珍珠香菇多糖提取效果的影响

准确称取1.0000 g珍珠香菇粉末，加入25 mL蒸馏水，设定提取温度60℃、超声波功率160 W，经过40 min～120 min不同时间的处理，3500 r/min离心10 min，取上清液，然后用3，5-二硝基水杨酸法测定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同提取时间对珍珠香菇菇多糖提取率率的影响见图3。

图3 超声波时间对珍珠香菇多糖提取率的影响Fig.3 Effects of extraction time on extration ratio of pearl lentinan

由图3可知，随着时间的延长，珍珠香菇多糖提取率明显增大，但是当提取时间大于80 min时，珍珠香菇多糖提取率反而有所下降。随着浸提过程的进行，珍珠香菇多糖逐渐溶入提取液，所以提取率会逐渐增加，但是如果提取时间过长，珍珠香菇多糖提取率会有所下降，这是因为超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而损失增大而影响多糖的得率。因此，提取时间为80 min较适宜。

2.1.3 不同超声功率对珍珠香菇多糖提取效果的影响

用天平准确称取1.0000 g珍珠香菇粉末，分别加入25mL蒸馏水，设定提取时间40min、提取温度60℃、液料比 25∶1（mL/g），处理后，3500 r/min 离心 10 min，取其上清液，3，5-二硝基水杨酸法测定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同超声波功率对珍珠香菇多糖提取率的影响见图4。

图4 超声波功率对珍珠香菇多糖提取率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on extration ratio of pearl lentinan

由图4可知，超声波功率设定在120 W～160 W之间时，功率逐渐增大，提取率也随之加大，这是因为超声波的机械剪切作用加强，粉末珍珠香菇细胞破坏更充分，有助于细胞多糖的溶出[7-8]；在160 W～200 W之间，随着超声波功率的增大，提取率逐渐下降，主要因为当超声功率大于160 W时，超声作用进一步加速了提取液的流动，减少了物料在超声场中的停留时间，破壁作用也就随之减弱，同时超声波也会破坏珍珠香菇多糖的结构，从而影响提取率。因此较适宜的超声波提取功率为160 W。

2.1.4 不同提取温度对珍珠香菇多糖提取效果的影响

用天平准确称取1.000 g珍珠香菇粉末，分别加入25mL蒸馏水，设定超声波功率160W、提取时间80min，经过20℃～100℃不同温度处理后，3500 r/min离心10 min，取上清液，然后用水杨酸法测定提取液的珍珠香菇多糖提取率，不同提取温度对珍珠香菇多糖提取率的影响见图5。

图5 提取温度对珍珠香菇多糖提取率的影响Fig.5 Effects of extraction temperature on extration ratio of pearl lentinan

从图5可看出，随着提取温度升高,珍珠香菇多糖提取率快速增加，温度升高到60℃以上，增长趋势趋于缓慢，从60℃～100℃珍珠香菇多糖提取率变化不大，因此从多糖得率和能源耗费平衡考虑，确定最佳提取温度为60℃。

2.2 正交试验

2.2.1 正交设计

由单因素试验结果可知，提取时间、超声波功率、提取温度、液料比4个因素的较优水平分别是：80 min、160 W、60 ℃和 25∶1（mL/g）。所以，在这些最优值附近选取较优水平，按L9（34）设计进行正交试验见表1。

表1 因素水平表Table 1 Coding of factors and levels

2.2.2 正交试验

正交试验结果见表2。从表2的直观分析可以看出，极值R反应了4个因素对多糖提取率的影响：RB>RA>RC>RD，即：因素对多糖提取率的影响顺序：超声功率、超声时间、提取温度、料液比。得出该正交试验的最佳组合为B2A2C2D2。即料水比为1∶25，超声时间60 min，提取温度为60℃，超声功率160 W。

表2 工艺正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.3 工艺验证试验

为验证上述的最佳工艺，按确定的最优工艺条件进行实验，提取并测定珍珠香菇多糖的含量，结果为7.71%，超过了正交试验中的测定值，说明优选的工艺是科学的。

3 讨论

超声波的强烈搅拌、振动、空化作用可以破坏细胞结构，加速有效物质的溶出[9]，超声波具有“空化现象”、“机械振动”以及“热效应”等特性。“空化现象”可产生瞬间几千帕压力，使提取介质中的微小气泡压缩、爆裂，破碎被提取原料的细胞壁，加速目标提取物的溶出，“机械振动”和“热效应”进一步强化了溶出成分的扩散，整个过程在瞬间完成，从而提高了破碎速度，缩短了破碎时间，极大地提高提取效率[10-11]。超声波萃取珍珠香菇多糖已经显示出其优势。本试验以珍珠香菇多糖作为检测指标，采用正交试验设计，确定了超声波提取珍珠香菇多糖的最佳工艺：料液比为1∶25，超声时间60 min，提取温度60℃，超声功率160 W，所得香菇多糖提取率为7.71%。

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