补中益气法对甲减大鼠心肌α-MHC和β-MHCmRNA表达的影响＊

高天舒，尹慧丝

(1.辽宁中医药大学附属医院内分泌科，沈阳 110032;2.辽宁大学医院，沈阳 110031)

甲状腺功能减退症(简称甲减)是临床常见的内分泌疾病，近年来有关甲减心肌损伤的报道不断增加。甲减心脏损伤最早由Zondek于1918年报道，肌球蛋白由Kuhne于1859年首先报道，是心肌的主要收缩蛋白。心脏是受TH调节的重要靶器官之一，肌球蛋白作为影响心肌收缩的主要结构蛋白，其重链(MHC)基因(α-MHC、β-MHC的基因)是甲状腺激素TH调节的重要靶基因。

中医学认为，原发性甲状腺功能减退症应归属中医学虚劳范畴。我们在临床工作中也发现，甲减发病之初多存在脾气虚，治疗上运用补中益气法治疗甲减取得了较好的疗效。补中益气汤具有调补脾胃、升阳举陷之功能，全方中黄芪益气为君，红参、白术、甘草补气健脾和中为臣，辅以陈皮、当归、升麻及柴胡使本方在临床上取得了较好的疗效。

我们前期研究还发现，补中益气法可以明显降低甲减大鼠血清CK、CK-MB水平，提高甲减鼠血清T3水平［1］，但对甲减心肌损伤的改善是否与调节肌球蛋白重链α和β基因表达有关未见报告。故本实验重点研究补中益气法对甲减大鼠心肌 α-MHC和β-MHCmRNA表达的影响，对进一步证实中药对甲减致心肌损伤的修复作用及其作用机制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 4周龄清洁级Wistar大鼠120只，体质量90g～120g，雌雄各半，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证号SCXK(京)2009-0004)。

1.1.2 动物饮食 普通饲料:由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。低碘饲料:根据卫生部地方病调查、中国医科大学流行病学结果以及承德市地方病研究所提供的资料，采用全国重度缺碘地区河北省承德市隆化县大两间房村的玉米、谷子、黄豆，按73∶20∶7的比例，加入适量的添加剂(每100g饲料添加 CaCO30.5g，Na2HPO40.15g，MnSO450mg，维生素 B66mg，维生素 B120.05mg，泛酸钙5.5mg，叶酸 0.1mg，CoCl24.95μg，宝力维他 20mg，酵母粉1g)，由沈阳市于洪区前民实验动物饲料加工厂制成低碘饲料，其碘含量为20 μg/kg。

1.1.3 试剂 大鼠血清 TT3、TT4放免试剂盒(北京赛博润特科技发展中心提供)、血清TSH测定试剂盒(美国 Rapid Bio公司)、冻干人尿中碘成分分析标准物质(购自国家碘缺乏病参照实验室)、cDNA合成试剂盒(宝生物工程大连有限公司)、荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司)、Triozol Reagent(美国Invitrogen Life technologies公司)、4%多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)、2.5%戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)、20%乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)、PBS缓冲液(国药集团化学试剂有限公司)、高氯酸钠(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)、左甲状腺素钠片(德国默克公司)。

1.1.4 仪器 小型台式离心机(美国SIGMA，1-13)、高速冷冻离心机 sigma 31k5C型(美国)、PCR扩增仪(德国 Biometra)、紫外分光光度计(英国 UV-visible Spectrometer，UV300)、ABI 7500 扩增仪、DK-8B型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、BIO-DAD 680 酶标仪、FJ-2008 PS γ 记数仪、切片机(德国 Leica公司)、心电图机(日本光电)、DS-671型电子秤(上海寺冈电子有限公司)、代谢笼(苏州市实验试剂玻璃仪器厂)、灌胃器(沈阳市实验试剂玻璃仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备和处理因素 甲减动物造模方法按照Kolaja法［2］制作，选用4周龄清洁级Wistar大鼠(90g～120g)，雌雄各半，每天饲以低碘饲料，同时喂含1%高氯酸钠的双蒸水19d，续喂双蒸水2d，造模成功后将实验组随机分成3组，即模型对照组、L-T4组、补中益气汤组，每组30只。

处理因素:正常对照组饲以普通饲料，每只鼠每天灌服4ml双蒸水;模型对照组低碘饮食，每日灌服4ml双蒸水;L-T4组低碘饮食，每天灌服 2ml含2.6μg/kg左甲状腺素钠片的混悬液(根据体重约1～2周增加2.6μg/kg)，并灌服等体积双蒸水;补中益气汤组低碘饮食，每天灌服 2ml含生药量13.96g/kg的补中益气汤(补中益气汤:升麻、柴胡、陈皮、当归、白术、红参、炙甘草、黄芪。按人的常规日处方剂量，按与人相同体表面积折算)，并灌服等体积的双蒸水。动物处死时间和数量:分别在给处理因素后的0、8周处死动物，每组每次相应处死12只动物。

1.2.2 标本采集 处死前1d将大鼠放入代谢笼中，留 24h空腹尿，吸取 3ml～5ml，放入 5ml eppendoff管中，－20℃冰柜中保存，用于尿碘测定。处死前称体重，20%乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，3000r/min离心 10min，血清存入 1.5ml eppendoff管中，－20℃ 冰柜中保存待测 TT3、TT4、TSH。处死后迅速摘取心脏，用预冷的生理盐水冲净心腔内残余血，滤纸吸净后称质量，取左心室心肌组织 2块，一块放入 1.5ml eppendoff管中，滴入1mlTrizol试剂，－80℃保存，用于实时定量 PCR的检测;一块于4%的多聚甲醛中固定，用于光镜标本的制作。摘取甲状腺，剥离残余结缔组织，置于4%的多聚甲醛中固定，用于光镜标本的制作。

1.2.3 甲状腺功能测定 血清促甲状腺激素(TSH)测定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法(ELISA法)，美国 Rapid Bio试剂盒。血清总 T3(TT3)、总T4(TT4)采用放射免疫分析法(RIA法)。

1.2.4 甲状腺形态学观察 分离甲状腺后，于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，5μm厚切片，进行HE染色光镜观察。

1.2.5 尿碘测定 采用中华人民共和国卫生部行业标准砷铈分光光度法。

1.2.6 心电图描记 各组随机抽取6只大鼠，于处死前1d乙醚麻醉，针状电极刺入大鼠上下肢内侧皮下，用心电图机记录肢体导联心电图，走纸速度50mm/s，标定电压 1mV=10mm。

1.2.7 心脏的脏器指数 称取大鼠体质量和心脏质量，计算心脏的脏器指数(脏器指数是指某脏器质量与体质量的比值，常以每100 g体质量计算)。

1.2.8 心肌细胞形态学观察 迅速摘取心脏，用预冷的生理盐水冲净心腔内残余血，取左心室心肌组织于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，5μm厚切片，进行HE染色，光镜观察。

1.2.9 心肌组织 α-MHC和 β-MHC mRNA的表达 心肌细胞总RNA的提取:于左心室取0.1g心肌组织，总RNA提取方法按照Triozol Reagent(美国Invitrogen Life technologies产品)试剂说明书进行。采用紫外可见光分光光度计(英国 UV-visible Spectrometer，UV300)测定 260nm、280nm OD 值，并计算RNA的纯度及含量。样品－80℃保存备用。

实时定量RT-PCR:①逆转录:应用cDNA合成试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)合成cDNA。取2μL总 RNA作为 imoban，oligo-dT做引物，反应体系为 20μL，反应条件为 37℃15min，85℃ 5s;②实时定量 RT-PCR:α-MHC、β-MHC 和内参照 β-actin基因扩增的引物序列均由北京华大基因公司设计并合成;③PCR反应体系为:SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL，PCR Forward Primer(10μM)0.4μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL，ROX Reference Dye II0.4μL，cDNA 模板 2μL，dH2O6.8μL，总反应体系为20μL。PCR循环条件为:95℃0.5min 1个循环，95℃5s，60℃ 34s40 个循环，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃15s1个循环。PCR结束后，分析结果并计算，利用SDS7000软件分析实时PCR实验结果。

表1 目的基因的实时定量RT-PCR引物序列

1.2.10 统计学处理 尿碘值用尿碘中位数表示，其余数值用均数±标准差(±s)表示。2个样本均数比较用t检验，2个以上样本均数比较用方差分析，P＜0.05为有统计学意义。全部数据均输入Excell工作表中，用 SPSS17.0软件包做统计学处理。

2 结果

2.1 血清甲状腺激素及TSH水平

表2 补中益气法对甲减Wistar大鼠甲状腺功能的影响(±s)

表2 补中益气法对甲减Wistar大鼠甲状腺功能的影响(±s)

注:与正常对照组比较:★★P＜0.01，★★★P＜0.001;与模型对照组比较:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;与 L-T4组比较:●●P＜0.01

组 别 处理时间 例数 血清TT3(nmol/L)TT4(nmol/L)TSH(mIU/L)0d 8 1.36±0.46 68.10±8.55 0.18±0.09对照组 8周 8 1.66±0.26 72.64±23.98 0.88±0.20模型组 0d 8 0.53±0.34★★★ 17.99±1.37★★ 3.01±1.97★★对照组 8周 8 0.92±0.29★★★ 28.30±17.73★★★ 4.51±1.01★★★L-T4组 0d 8 0.59±0.12★★★ 35.03±19.38★★★ 2.71±0.52★★★8周 8 2.16±0.26△△△ 87.32±6.55△△△ 1.56±0.08△△△补 中 0d 8 0.78±0.18★★★ 18.63±1.54★★★ 2.54±0.2★★益气组 8周 8 1.72±0.45△△ 72.97±25.75△△△ 0.93±0.03正常组△△●●

2.2 甲状腺形态学观察

正常组大鼠甲状腺滤泡大小一致，呈圆形或不规则形，滤泡上皮多为立方形，滤泡腔内胶质均匀(图1);模型组甲状腺滤泡萎缩，上皮细胞呈高柱状增生，滤泡腔内胶质缺少甚至消失，小血管扩张充血(图2);治疗8周后2组均有所改善，部分甲状腺滤泡上皮逐渐变扁，补中益气汤组与 L-T4组比较，甲状腺滤泡略大，滤泡上皮呈低柱状，腔内胶质较多，优于 L-T4组(图 3、图 4)。

图1 正常组8周时(HE染色×400)

图2 模型组8周时(HE染色×400)

图3 L-T4组8周时(HE染色×400)

图4 补中益气汤组8周时(HE染色×400)

2.3 尿碘结果

2.4 心电图表现

表3显示，模型组大鼠与正常组比较心率减慢，QRS波峰值电压降低(P＜0.01)，提示心肌供血不足;治疗后2组均有所改善，但2组之间比较无差异，大鼠心电图见下图(图5～图8)

表3 各组 MUI值(μg/L)

2.5 心脏指数

模型对照组大鼠心脏指数明显高于正常对照组(P＜0.01)，其余各组之间差异无统计学意义。

2.6 心肌细胞形态学观察

正常组大鼠心肌细胞肌丝排列整齐，横纹清晰，胞核明显，无细胞肿胀(图9);模型组大鼠心肌细胞肿胀，部分胞浆溶解、消失，液化性坏死，胞浆染色淡且模糊，肌纤维断裂，肌纹消失和间质水肿(图10);治疗8周后各组均有所改善，补中益气汤组优于LT4组(图 11、图 12)。

表4 大鼠心电图心率、QRS波峰值电压(±s)

表4 大鼠心电图心率、QRS波峰值电压(±s)

注:与正常对照组比较:★★P＜0.01;与模型对照组比较:△△P＜0.01，△△△P ＜0.001

组别 处理时间(周)例数心率(次/min)QRS波峰值电压(mV)8 6 339±35 0.46±0.03模 型 对 照 组 8 6 230±23★★ 0.25±0.03★★L - T4 组 8 6 432±27△△ 0.53±0.18△△补中益气汤组 8 6 476±9△△△ 0.58±0.09正常对照组△△△

表5 大鼠心脏指数(±s)

表5 大鼠心脏指数(±s)

注:与正常对照组比较:★★P＜0.01

组别 处理时间(周)例数 心脏指数(g/100g)正常对照组88 0.34±0.03 0.33±0.06模 型 对 照 组 8 8 0.38±0.04★★L - T4 组 8 8 0.35±0.04补中益气汤组88

图5 正常对照组心电图

图6 模型对照组心电图

图7 L-T4组心电图

图8 补中益气汤组心电图

图9 正常组8周时(HE染色×400)

图10 模型组8周时(HE染色×400)

图11 L-T4组8周时(HE染色×400)

图12 补中益气汤组8周时(HE染色×400)

2.7 心肌组织α-MHC和β-MHC mRNA的表达

表6显示，甲减时，心肌细胞 α-MHC mRNA表达下调，受TH负向调节的β-MHC mRNA表达量呈显著上升。治疗8周后，α-MHC mRNA表达增加，β-MHC mRNA表达量减少，补中益气汤组均优于LT4组。用2－ΔΔCT法来决定目的基因在各组表达的相对水平。

表6 α-MHC与β-MHCmRNA的相对表达量

3 讨论

肌球蛋白是影响心肌收缩的主要结构蛋白，正常情况下，肌球蛋白存在于心肌细胞质内，是一个六聚体大分子，可分为2条重链(MHC)和4条轻链(MLC)。重链分为α型和β型2种，α链有很强的ATP酶活性，能使ATP转化为ADP，引起心肌收缩，而β链的转化能力较弱。TH能够促进α-MHC基因的表达，抑制β-MHC基因的表达，使编码α链的mRNA增多，ATP转化为ADP的能力增强，从而提高心肌的收缩力［3，4］。甲减时，TH 分泌减少，心肌细胞α-MHC mRNA表达下调，受TH负向调节的β-MHC mRNA表达量呈显著上升。刘桂芝［5］等人的实验证明，大鼠长期碘缺乏会出现较严重的甲减，心肌细胞中受TH调节的靶基因α-MHC mRNA表达下调，而β-MHC mRNA表达明显上调，导致心肌收缩力显著减弱而影响心脏的功能。

TH的生物学作用主要是 T3与结合到DNA基因调节部位的T3受体(T3R)及其与相关蛋白的相互作用，通过调控靶基因的转录和表达而实现的。T3R在胞浆合成后，转移到细胞核，与靶基因上的TRE(甲状腺激素反应元件)结合，而不是像其他类固醇激素受体那样，以激素受体复合物的形式进入细胞核。TRE常位于靶基因转录起始部的上游［6］。甲状腺激素首先与心肌甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor，TR)结合，活化的受体再与甲状腺激素调控基因上的甲状腺激素反应元件 (thyroid hormone response element，TRE)结合，启动甲状腺激素调控基因转录。甲状腺激素就是这样通过TR来调控甲状腺激素调控基因表达水平，从而发挥其正常生理调控功能，TR是甲状腺激素发挥作用的重要桥梁［7］。

补中益气汤为低碘含量的方剂，而非富碘方剂。我们前期研究发现，在治疗瘿病的中药中，海藻、昆布为碘含量丰富的中药即富碘中药，其中药饮片碘含量分别为682.46μg/kg和 794.69μg/kg，而当归中药饮片的碘含量仅为1.58μg/kg，当归汤剂的碘含量也仅为31.67g/L［8］。从大鼠 MUI的数值来看，各组大鼠碘的供给量在整个实验过程中是较恒定的，治疗后补中益气汤组大鼠的尿碘中位数并未明显提高，可见补中益气汤为低碘方剂，而非富碘方剂。

本实验中，8周后甲减大鼠的心肌有了不同程度的损伤，心肌细胞肿胀，部分胞浆溶解、消失，液化性坏死，胞浆染色淡且模糊，肌纤维断裂，肌纹消失和间质水肿，心肌 α-MHC的 mRNA表达下调，β-MHC的mRNA表达上升。与正常组比较，模型组大鼠α-MHC的mRNA表达下调0.89倍，L-T4组、补中益气汤组分别上升1.77倍、2.32倍，补中益气汤组上升明显;模型组大鼠 β-MHC的 mRNA的表达上升5.66倍，L-T4组、补中益气汤组分别下调至正常组的2.61倍、1.17倍，补中益气汤组下调明显。补中益气法明显提高甲减大鼠 TT3、TT4水平，与 L-T4疗效相当，在心肌细胞形态学的恢复、调节心肌 α-MHC、β-MHCmRNA的表达上明显优于 L-T4，说明补中益气法在甲减心肌损伤的修复中起重要作用，其作用机制与提高心肌α-MHCmRNA的表达、降低心肌β-MHCmRNA的表达密切相关，但是否与提高心肌TR的表达及受体后的作用有关有待于进一步研究。

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