RP-HPLC法测定不同产地不同部位贯叶金丝桃中金丝桃苷的含量Δ

李卓恒，孟德胜，卢来春，周 薇，于彩平，藕顺龙，吴 畏

（第三军医大学大坪医院/野战外科研究所药剂科，重庆 400042）

RP-HPLC法测定不同产地不同部位贯叶金丝桃中金丝桃苷的含量Δ

李卓恒＊，孟德胜，卢来春，周 薇，于彩平，藕顺龙，吴 畏#

（第三军医大学大坪医院/野战外科研究所药剂科，重庆 400042）

目的：建立测定贯叶金丝桃中金丝桃苷含量的方法，并测定不同产地不同部位贯叶金丝桃中金丝桃苷的含量。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V），检测波长为360 nm，流速为1.0 mL·min－1。结果：金丝桃苷进样浓度在0.14～2.80μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 4），平均加样回收率为95.97%，RSD＝1.16%（n＝6）。四川产地贯叶金丝桃花、叶中的金丝桃苷含量最高。结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于贯叶金丝桃的质量控制。

贯叶金丝桃；金丝桃苷；反相高效液相色谱法；含量测定；产地

贯叶金丝桃（Hypericum performatum L.）为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，其味苦、辛，性平，可清心明目、调经活血、止血生肌、解毒消炎[1]，传统医学将其用于治疗感染、妇科疾病、痛疖肿毒等皮肤疾病，疗效较好。金丝桃苷是该药材的主要活性成分之一。现代药理学研究表明[2]，金丝桃苷具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降血压、降低胆固醇、抗肿瘤、预防糖尿病等作用，具有很大的新药研发价值。目前，金丝桃苷主要从植物中提取，很多植物中都能提取出金丝桃苷，如：贯叶金丝桃（H.perforatum L.）、红旱莲（H.ascyron L.）、黑木相思树（Acacia melanoxylon R.Br）等，其中贯叶金丝桃中金丝桃苷的含量最高，可达1.257%。但是，不同产地贯叶金丝桃中所能提取出的金丝桃苷含量不同。为对不同产地的贯叶金丝桃进行筛选及质量控制，本试验选取不同产地的贯叶金丝桃药材，并对该药材的不同部位进行单独提取，以金丝桃苷含量为指标，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法检测其含量[3，4]，为判断金丝桃苷含量最高的贯叶金丝桃提供理论依据。

1 仪器与试药

125/166型HPLC仪（美国Beckman公司）；BC124S型万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；RE-201C型恒温水浴锅、08030125型旋转蒸发仪、SHE-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；KQ-500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器厂）。

金丝桃苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111521-200303）；甲醇（色谱纯，韩国SK化工株式会社）；水为纯化水。贯叶金丝桃购自重庆慧远药业有限公司，分别于2010年采自云南、四川、甘肃，均经重庆市食品药品检验所鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V）；检测波长：360 nm；流速：1.0 mL·min－1；进样量：20μL。在此色谱条件下，金丝桃苷与提取物中其他成分有较好的分离度。色谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取金丝桃苷对照品3.5 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度为140μg·mL－1的对照品贮备液。精密吸取该溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇定容，即得浓度为1.4μg·mL－1的对照品溶液。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.金丝桃苷Fig 1 HPLCchromatogramsA.substancecontrol；B.negativecontrol；C.test sample；1.hyperoside

2.3 供试品溶液的制备

精密称取贯叶金丝桃的花、叶（贯叶金丝桃全草的中上段长有花、叶，故在本试验中合为一个部位计算）和茎部位各5.0 g，剪碎，放入烧瓶中，加100 mL无水乙醇，超声（功率：500 W，频率：400 kHz）提取10 min，再80℃水浴回流2 h。真空抽滤，滤液于4℃贮藏，滤渣加50 mL无水乙醇，重复回流提取2次，合并滤液。旋转蒸发仪于80℃下浓缩，将浓缩液溶解于10 mL二甲基亚砜中，并移至50 mL棕色量瓶，用甲醇定容，得样品提取液。吸取相应量样品提取液（花、叶部位提取液取1 mL，茎部位提取液取10 mL），分别置10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，1 000 r·min－1离心10 min，取上清液，即得到不同产地不同部位贯叶金丝桃的供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

取适量无水乙醇置烧瓶中，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

精密量取140μg·mL－1的对照品贮备液10、25、50、100、200μL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，得浓度分别为0.14、0.35、0.70、1.40、2.80μg·mL－1的对照品溶液。按上述色谱条件，每个浓度进样3次，每次进样20μL，测定峰面积。以对照品的进样浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝2.171 9X+0.066 6（r＝0.999 4，n＝5）。结果表明，金丝桃苷进样浓度在0.14～2.80μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密量取对照品贮备液50μL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，得浓度为0.70μg·mL－1的溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样20μL，测定峰面积。结果，RSD＝1.54%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一产地同一部位（甘肃药材的花、叶部位）样品适量，按“2.3“项下方法平行制备6份供试品溶液。将供试品溶液分别稀释100倍，按上述色谱条件分批进样测定。结果，RSD＝6.1%（n＝6）。

2.8 稳定性试验

取同一批样品（甘肃药材的花、叶部位）的供试品溶液适量，稀释100倍后于0、1、2、3、4 h时间点按上述色谱条件分别进样分析，测定峰面积。结果，RSD＝1.73%（n＝5），表明供试品溶液在4 h内稳定。

2.9 加样回收率试验

精密称取已测定金丝桃苷含量的同一批样品（甘肃药材的花、叶部位）适量，共6份，分别精密加入金丝桃苷对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，稀释100倍后按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3个产地不同部位的贯叶金丝桃药材适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件进样测定峰面积，计算样品中金丝桃苷的含量，结果见表2。

表2 不同产地不同部位贯叶金丝桃中金丝桃苷的含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of hyperoside in H.perforatum from different habitats（n＝3）

3 讨论

由表2可知，不同产地不同部位的金丝桃苷含量具有差异，花、叶中的金丝桃苷含量普遍较茎中高；不同产地花、叶中的金丝桃苷含量比较，四川＞云南＞甘肃；不同产地茎中的金丝桃苷含量比较，甘肃＞云南＞四川。故在金丝桃苷提取试验中，建议选取四川产地贯叶金丝桃的花、叶部位为提取原料。

由线性关系考察结果可知，金丝桃苷进样浓度在0.14～2.80μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。但由于不同产地不同部位的金丝桃苷含量差异较大，在取用药材时可能导致取材的不均一性，因此在重复性试验中RSD＞6%。

综上所述，本方法简便、准确、灵敏度高，可用于贯叶金丝桃的质量控制，同时也为本课题组对金丝桃苷的进一步研究提供了试验依据和技术支持。

[1] 胡 然，库宝善，张永鹤.人类免疫缺陷病毒与疱疹病毒感染具有相关性[J].生理科学进展，2004，35（1）：63.

[2] 李敏芳，李 慧，王学美.金丝桃苷药理研究进展[J].中国中医药信息杂志，2008，15（4）：102.

[3] 谭道鹏，桂 新，王峥涛.HPLC测定千柏鼻炎片中对羟基桂皮酸和金丝桃苷的含量[J].中国现代应用药学，2010，27（6）：532.

[4] 樊敏伟，马能溢，王 冰，等.高效液相色谱法测定贯叶金丝桃提取物缓释胶囊中金丝桃苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（11）：9.

Content Determination of Hyperoside in Different Parts of Hypericum perforatum from Different Habitats by RP-HPLC

LI Zhuo-heng，MENG De-sheng，LU Lai-chun，ZHOU Wei，YU Cai-ping，OU Shun-long，WU Wei
（Dept.of Pharmacy，Institute of Field Surgery，Daping Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To develop the method for the content determination of hyperoside in Hypericum perforatum，and to determine the content of hyperoside in different parts of H.perforatum from different habitats.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.1%phosophoric acid（40∶60，V/V）at the flow rate of 1.0 mL·min－1.The detection wavelength was set at 360 nm.RESULTS：The linear rang of hypericin was 0.14～2.80μg·mL－1（r＝0.999 4）with an average recovery of 95.97%（RSD＝1.16%，n＝6）.The contents of hypericin in the flowers and leaves of H.perforatum from Sichuan province were the highest.CONCLUSION：The method is simple，accurate and reproducible for the quality control of H.perforatum.

Hypericum perforatum；Hyperoside；RP-HPLC；Content determination；Habitats

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）43-4082-02

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.19

Δ国家自然科学基金资助项目（81073157）；重庆市科技攻关课题（CSTC，2010AC5023）

＊药师，硕士。研究方向：药学及新药研发。电话：023-68757098。E-mail：cissylzh@yahoo.cn

#通讯作者：主管药师，硕士。研究方向：医院药学及新药研发。电话：023-68757099。E-mail：cqcx@163.com

2011-12-22

2012-05-03）