双黄花片HPLC指纹图谱的研究及其绿原酸和黄芩苷含量测定

王 华，蔡 萍，万 丹

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南省中医药研究院超微工程中心，湖南 长沙410013）

双黄花片由金银花、黄芩、黄芪等中药组成，具有抗流感病毒之功效[1-2]。临床主要用于治疗流感，疗效可靠且毒副作用较小。中药制剂指纹图谱已广泛应用于中药质量控制领域，尤其适合中药材和中药提取物的整体质量评价。本文采用高效液相色谱法建立10 批双黄花片指纹图谱，比较不同批次双黄花片的相似度，以完善双黄花片的质量标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 全自动高效液相色谱仪系统，包括四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器。AE-240 型分析天平（METTLER）。

1.2 对照品与样品

绿原酸对照品（批号：110753-200212）；黄芩苷照品（批号：110715-200212）均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。10 批双黄花片由湖南省中医药研 究 院 提 供，批号 分 别 为20100101、20100102、20100103、20100104、20100105、20100106、20100107、20100108、20100109、20100110。

1.3 试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长为280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温为25 ℃；乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相；按表1进行梯度洗脱。

表1 流动相洗脱梯度

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品6.4 mg，加50%甲醇制得浓度为0.064 mg/mL 的绿原酸对照品溶液。精密称取黄芩苷对照品9.2 mg，加甲醇制得浓度为0.092 mg/mL 的黄芩苷对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品约0.1 g，精密称定，置于250 mL 容量瓶圆底烧瓶中，加甲醇50 mL，置水浴加热回流30 min，放冷，移置100 mL 容量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇定容，振荡混匀后，滤过，吸取滤液过0.45 μm 微孔滤膜，备用。

2.4 参照峰的选择

黄芩苷是本制剂有效成分之一，在HPLC 图谱中峰面积大，出峰时间适中且稳定，故选择黄芩苷为参照峰[3]。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密量取绿原酸对照品溶液4、6、8、10、12 μL，黄芩苷对照品溶液2、4、6、8、10 μL，按上述色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标，相应峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表2。

表2 绿原酸和黄芩苷线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，连续进样6 次，记录指纹图谱。以6 号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD 值均在0.5%以下，各共有色谱峰相对峰面积间的RSD 值均在5.0%以下，根据峰面积计算，绿原酸、黄芩苷的RSD 分别为0.51%、0.85%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 进样，记录指纹图谱。以6 号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD 值均在0.5%以下，各共有色谱峰相对峰面积间的RSD 值均在5.0%以下，根据峰面积计算，绿原酸、黄芩苷的RSD 分别为0.38%、1.33%，表明样品溶液在12 h 内测定结果稳定。

2.5.4 重复性试验 取同一批样品6 份 （批号：20100101），按供试品制备方法进行制备，记录指纹图谱。结果，各共有色谱峰保留时间的RSD 值均在0.5%以下，各共有色谱峰相对峰面积间的值均在5.0%以下，根据峰面积计算，绿原酸、黄芩苷的RSD分别为0.63%、0.77%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含量的样品 (批号：20100101)约0.05 g，精密称定，分别精密加入适量绿原酸、黄芩苷对照品，按“2.3” 项下操作，结果绿原酸的平均加样回收率为97.16%，RSD 为1.47%；黄芩苷的平均加样回收率为97.23%，RSD为1.30%。结果表明，本方法加样回收率良好，见表3～4。

表3 绿原酸加样回收率测定 （mg）

表4 黄芩苷加样回收率测定 （mg）

2.6 指纹图谱的建立

将各供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定各样品的HPLC 指纹图谱，经比较分析，确定10 个色谱峰为双黄花片的共有峰，见图1。通过与对照品图谱（图2）比较，表明3 号峰为绿原酸，6 号峰为黄芩苷。

2.7 指纹图谱相似度的计算

采用中国药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件（2.0 版）对10 批样品进行相似度评价。设置第一批样品图谱为参照物图谱，时间窗0.5，中位数法，多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱（见图1），10 批样品的相似度达到0.8 以上，相似度计算结果见表5。

图1 双黄花片10 批样品的HPLC 图谱及对照指纹图谱

图2 绿原酸、黄芩苷对照品及双黄花片样品HPLC 图

表5 10 批双黄花片样品指纹图谱相似度

2.8 含量测定

按“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表6。

表6 10 批双黄花片样品中绿原酸、黄芩苷的含量测定 （%）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

比较了乙腈-水、乙腈-0.4 mol/L 磷酸水溶液及乙腈-0.2 mol/L 磷酸水溶液，结果发现加了磷酸的流动相峰形较好，0.2%与0.4%的磷酸水溶液相比，出峰情况相似，所以采用乙腈-0.2 mol/L 磷酸水溶液的流动相。样品在280 nm 有较强的吸收，并且在该波长下检测，色谱图峰形最好，出峰数目适中，各色谱峰相互之间分离度较好，故检测波长定为280 nm。

3.2 特征色谱峰的选择

研究选择的2 个特征色谱峰，为双黄花组方的2 味中药金银花、黄芩的2 种成分绿原酸和黄芩苷。现代药理研究表明，黄芩中的黄芩苷是最主要的活性成分之一，具有较好的抗菌、抗病毒作用[4]；金银花中的绿原酸也具有较好的抗菌、抗病毒作用[5]，故黄芩苷、绿原酸作为评价双黄花片质量标准的特征成分。

[1]蔡光先，张水寒，王宇红，等.一种用于治疗病毒性呼吸道感染疾病的中药有效部位组合物[P].中国专利：N201010143011.7，2010-09-01.

[2]蔡光先，朱光葵，张水寒，等.抗病毒中草药组合物、中药组合物及其制备方法[P].中国专利：CN201110001291.2，2011-05-25.

[3]付 克，张 丽，闫广利.柴芩清肝汤高效液相色谱指纹图谱研究[J].时珍国医国药，2010，21(10): 2 564-2 565.

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