九香止泻片对湿热型泄泻肠易激综合征模型大鼠AQP4、PKA与cAMP表达的影响

谭 洁，滕久祥，彭芝配，马 薇，殷 坚

（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床上最常见的一种胃肠道功能紊乱性疾病，临床上有腹泻型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、腹泻便秘交替型（IBS-A）三个亚型，而以腹泻型居多。近年来大量文献证实环腺苷酸-环腺苷酸依赖性蛋白激酶（cAMP-PKA） 信号通路参与了水通道蛋白的表达，在IBS 病理生理过程中起重要作用。九香止泻片是以民间验方为基础，在传统中医理论指导下，结合临床经验而拟定，经多年临床应用，疗效确切。本研究期望通过九香止泻片对湿热型泄泻肠易激综合征（脾胃湿热型） 模型大鼠肠道AQP4、PKA 表达和cAMP 含量的影响来探讨其作用机制，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体质量（180±20）g。由上海希普尔-必凯试验动物有限公司提供[许可证号：SCXK(沪)2003-0002]。

1.1.2 药物 （1）九香止泻片：由秦皮、木香、白头翁等药组成。批号20070108，湖南德康制药有限公司提供。将药片碾碎后放入量杯中加0.9%生理盐水溶解，过滤取汁，配制成含生药1.227 g/mL 药液，置4 ℃保存备用；（2） 盐酸洛哌丁胺胶囊：2 mg/粒，批号080129233，西安杨森制药有限公司提供，将盐酸洛哌丁胺胶囊内容物放入量杯内加0.9%生理盐水溶解，配制成0.108 mg/mL 药液，4 ℃保存备用。

1.1.3 试剂（1）乌拉坦：长沙分路口化工厂生产，批号060109；（2）AQP4 免疫组化试剂盒：武汉博士得生物有限公司；（3）PKA 免疫组化试剂盒：武汉博士得生物有限公司；（4）cAMP 放免试剂盒：北京华英生物技术研究所，产品编号：HY-093；（5）北京产二锅头：60 度；（6）高糖高脂饲料（自制，在普通饲料中混入12%猪油，8%蜂蜜，糖脂的含量比为2∶3）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 选用40 只SPF 级SD 大鼠，体质量180～200 g，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、九香止泻片组、盐酸洛哌丁胺对照组4 组，每组10只，所有大鼠均单只单笼饲养，笼底铺上滤纸，以便观察其大便情况。

1.2.2 造 模 及 给 药 方 法 （1） 空 白 组：在22～25 ℃，40%～60%相对湿度的环境下，以普通饲料喂养；（2）其他各组：将肠易激综合征慢性应激动物模型和廖氏[1]脾胃湿热证模型相结合，自创湿热泄泻型肠易激综合征模型[2]。造模方法：以高糖高脂饲料喂养；第8 天置于造模箱，箱内温度（32±2）℃，相对湿度90%～95%；从第15 天开始灌服北京产二锅头(2 mL/200 g，1 次/d)，共7 d；同时分别给予：禁食、禁水、夹尾、高温环境、冷刺激、明暗颠倒、水平振荡[2]。上述方法每7 d 为1 周期。在模型处理期间，每日仅予大鼠一种处理，顺序随机，但任何连续2 d 内所予处理均不相同，让大鼠不能预料刺激的发生，共持续3 周。21 d 后移出置于自然环境，12 h 后九香止泻片组和盐酸洛哌丁胺组分别给予药液给药体积10 mL/（kg·d），给药剂量为12.27 g/(kg·d)，给药剂量均按60 kg 成人体表面积换算，盐酸洛哌丁胺药液给药体积10 mL/(kg·d)，剂量为1.08 mg/(kg·d)，连续灌胃7 d；空白组、模型组以等量生理盐水10 mL/(kg·d)连续灌胃7 d。7 d 后动物经腹腔麻醉后取血处死，进行指标检测。

1.2.3 大鼠肠道标本制备 取各组大鼠的回盲部、结肠（距肛门5 cm）各0.5 cm，立即用生理盐水冲洗，10%中性缓冲福尔马林液固定后，常规石蜡包埋切片。

1.2.4 一般形态学观察 大鼠肠道苏木素一伊红(haematoxylin-eosin，HE)染色：取大鼠回盲部及结肠的石蜡标本进行连续切片，片厚4 μm，每1 个部位取2 张，HE 染色后光学显微镜下观察组织的形态、结构。

1.2.5 免疫组化法 大鼠肠道AQP4、PKA 表达采用免疫组化法进行测定，通过镜检、图像采集，利用图像分析系统测5 个视野灰度值，取其均值，进行定量分析。

1.2.6 放免法 大鼠肠道cAMP 含量采用放免法进行测定分析，按照cAMP 检测试剂盒所要求的实验步骤，称取肠组织100 mg，加入2 mL 冰醋酸匀浆后，再加入2 mL 无水乙醇，混匀，静止5 min，3 500 r/min 离心15 min，取上清液，残渣加入75%乙醇2 mL 洗沉淀，匀浆分散，混匀，3 500 r/min 离心15 min，合并上清液，-20 ℃保存待测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况观察

造模后大鼠精神萎靡，倦怠，嗜卧懒动，反应迟钝，大便稀或溏泄，渐见肛周污秽；饮食量下降，体重增长缓慢，皮毛枯槁无光泽，竖毛；IBS 模型组大鼠易激惹，糖水摄取量明显减少，与相关文献[3]报道一致；九香止泻片组与盐酸洛哌丁胺组在分别灌服相应药物后，上述症状有明显改善。各组大鼠结肠粘膜HE 染色结果示结肠粘膜完整，未见粘膜器质性损害。

2.2 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道cAMP表达的影响

模型组中cAMP 的含量明显少于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；经药物干预后，九香止泻片组、盐酸洛哌丁胺组大鼠肠道中cAMP 的含量与模型组比较显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组间与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

2.3 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道PKA表达的影响

模型组肠道中(回盲部、结肠远端)PKA 的表达明显少于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；经药物干预后，九香止泻片组、盐酸洛哌丁胺组大鼠肠道中PKA 的表达与模型组比较显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组间比较及两组与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2，图1、2。

表1 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道cAMP 表达的影响 （±s，n=10，nmol/L）

表1 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道cAMP 表达的影响 （±s，n=10，nmol/L）

注：与空白组比较※P＜0.05；与模型组比较＃P＜0.05。

组 别空白组模型组九香止泻片组盐酸洛哌丁胺对照组药物剂量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3 cAMP 0.72±0.21 0.52±0.14※0.82±0.32＃0.90±0.43＃

表2 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道PKA 表达的影响 （±s，n=10）

表2 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道PKA 表达的影响 （±s，n=10）

注：与空白组比较※P＜0.05；与模型组比较＃P＜0.05。

组 别空白组模型组九香止泻片组盐酸洛哌丁胺对照组药物剂量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3回盲部148.93±21.30 94.28±11.87※135.19±18.91＃145.00±29.78＃结肠远端166.81±29.89 127.89±20.13※167.10±20.61＃162.31±19.15＃

图1 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道（回盲部）PKA 表达的影响（免疫组化染色光镜图，×400）

图2 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道（结肠远端）PKA 表达的影响（免疫组化染色光镜图，×400）

2.4 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道AQP4表达的影响

模型组肠道中(回盲部、结肠远端)AQP4 的表达明显少于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；经药物干预后，九香止泻片组、盐酸洛哌丁胺组大鼠肠道中AQP4 的表达与模型组比较显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；给药组与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。大鼠肠道中AQP4 的表达由结肠近端向结肠远端逐渐减少。结果见表3，图3、4。

表3 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道AQP4表达的影响 （±s，n=10）

表3 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道AQP4表达的影响 （±s，n=10）

注：与空白组比较※P＜0.05；与模型组比较＃P＜0.05。

组 别空白组模型组九香止泻片组盐酸洛哌丁胺对照组药物剂量（g/kg）— —12.27 1.08×10-3回盲部148.37±15.80 112.33±37.23※148.12±27.50＃146.37±32.65＃结肠远端125.73±10.09 89.37±9.40※138.63±25.84＃141.91±27.71＃

图3 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道（回盲部）AQP4 表达的影响（免疫组化染色光镜图，×400）

图4 九香止泻片对湿热型泄泻IBS 大鼠肠道（结肠远端）AQP4 表达的影响（免疫组化染色光镜图，×400）

3 讨论

肠易激综合征（IBS）是一种常见的胃肠功能紊乱性疾病。至今，IBS 发病机制尚不清楚，近年研究发现，cAMP-PKA 信号通路介导下的AQP4 异常表达在IBS 病理生理过程中起关键作用。国内有研究显示AQP4 在结肠中的分布表现为近端表达水平高于远端，黏膜顶部高于底部，细胞的基底面和腔面高于侧壁，吸收细胞表达明显而杯状细胞无表达[4]。这种空间排列的方向性与结肠对水分的吸收具有相适应性，研究表明结肠腺管是液体吸收的主要位点。王晓玲等[5]通过复制大鼠腹泻模型研究腹泻状态下AQP4 的表达情况，结果提示腹泻时升、降结肠AQP4 均较正常组减少，从病理学角度证明了水通道蛋白在结肠水重吸收中具有重要的生理学作用，这很可能是某些腹泻相关性疾病的共同病理生理的转归。

同时，有研究[6-7]发现cAMP—PKA 信号通路介导AQPs 的运输、门控以及重新分布。AQP 磷酸化为cAMP 依赖性，即在某些因素作用下，腺苷酸环化酶被激活，使细胞内cAMP 增加，进而活化PKA 或PKC，PKA 或PKC 催化水通道蛋白上的丝氨酸磷酸化，从而增加膜对水的通透性。

中医学根据腹泻型IBS 的临床表现，与中医学中“泄泻”相似，其病程较长，属久泻。其病机为脾阳不运，肝郁脾虚，兼夹肠中湿热，常出现虚实夹杂，寒热交错。九香止泻片由秦皮、木香、白头翁等药组成。对湿热泄泻型IBS 有较好的治疗作用。方中秦皮清热燥湿，为君药；木香行气调中止痛，为臣药；佐以白头翁清热燥湿，凉血止痢；诸药合用具有健脾清热燥湿，涩肠止泻，行气止痛之功。

本实验结果显示：湿热泄泻型IBS 模型大鼠肠道中AQP4、cAMP 与PKA 的表达明显减少 （P＜0.05），且大鼠肠道中AQP4 的表达由结肠近端向结肠远端呈逐渐减少趋势[4]；给予药物干预后，其肠道AQP4、cAMP 与PKA 的表达均明显增强，表明九香止泻片可能通过激活IBS 模型大鼠肠道中腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP 增加，进而活化PKA，PKA 进一步催化AQP4 上的丝氨酸磷酸化，从而增加膜对水的通透性，促进结肠对肠腔内水分的重吸收，使粪便得到浓缩，从而改善腹泻症状。

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