脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学比较研究

王 立，梁清华，陈晓玲，阳 历，唐 科，刘建军，贝玉章

（1.浏阳市集里医院神经内科，湖南 浏阳430100；2.中南大学湘雅医学院中西结合研究所，湖南 长沙410008）

蛋白质组学研究基因的最终表达产物是具有活性的蛋白质，以蛋白质双向电泳和新型质谱分析为技术平台，同条件和状态下蛋白质组的性质和变化规律，是后基因组时代的研究重点。目前脑梗死的发生机制虽然复杂，但归纳起来不外虚（阴虚、气虚）、火、风、痰、瘀几个方面。有人从脑梗死患者四诊信息和检测指标的搜集，运用聚类分析、对应分析、因子分析和结构方程等统计方法，初步将本病分为风瘀证、阴虚证、气虚证、火热证、痰湿证，然而脑梗死证的本质研究还没有确切结论。为进一步探讨脑梗死各种证型之间关联因素，本实验采用双向凝胶电泳分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清，用PD-QUES 分析2D电泳图谱，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 分析获取肽质量指纹图谱（PMF），Mascot 软件检索SwissProt 数据库鉴定蛋白质点，从蛋白质组学角度比较脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证，从更深层次阐明脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证，研究其蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，阐明脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证的病理生理机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

实验组：脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证患者为2010年2月至2011年10月浏阳市集里医院门诊及住院病人。其诊断标准参照第六版《神经内科学》脑梗死诊断标准[1]。肝阳化风证与阴虚风动证辨证标准参照中南大学湘雅医学院中西结合研究所制定的标准[2]：肝阳化风证 眩晕欲倒，肢麻，手足震颤，语言謇涩，半身不遂。阴虚风动证 手足蠕动或筋肉掣动，午后潮热，盗汗，口干咽燥，形体消瘦。共收集病例32 例，其中男性17 例，女性15 例；年龄41～68 岁，平均年龄（52.7±8.1）岁。对照组：10 例均为健康者，其中男性6 例，女性4 例；年龄40～64 岁，平均年龄（52.7±6.9）岁。全部病例均排除心、肝、肾等功能不全者，有活动性胃肠病变者，血液及内分泌系统疾病者，过敏体质者，孕期或哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 试剂 二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺、双向凝胶电泳标准蛋白质、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶、碳酸氢铵、三氟乙酸、乙睛和基质а-氰基-4-羟基肉桂酸均为Sigma 公司产品，固相pH 梯度干胶条，IPG 缓冲液、两性电解质、覆盖液、低分子量标准蛋白质和尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘 氨 酸、Tris、CHAPS、SDS 均 为 Amersham Biosciences 产品，甲醛和EDTA 二钠，考马斯亮蓝G250为国产分析纯。

1.2.2 仪器 IPGphor 等电聚焦仪、Ettan DALT 垂直电泳槽、PD-QUEST 凝胶图像分析软件、Imagescanner扫描仪、Labscan 扫描控制和分析前处理软件。

1.2.3 标本采集及处理 取脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证患者及正常人外周静脉血3～4 mL 于非抗凝的灭菌离心管中，室温下静置1 h，离心10 min（3 000 r/min）后，吸取上清液。

1.2.4 血清蛋白的提取 按Sigma 公司ProteoPrep Blue Albumin Depletion Kit 去除白蛋白与IgG，BCA 蛋白定量试剂盒测蛋白质浓度，其余上清分装置-70 ℃备用。

1.2.5 双向凝胶电泳 （1） 第一向等电聚焦（IEF）：IPG-DALT 主要参照IPGphor 等电聚焦系统使用指南进行血清蛋白与水化液。30 V 水化14 h 后依次经100 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 8.5 h 进行等电聚焦，水化和聚焦均在20 ℃进行，总电压时间积为68 000 Vh；（2）平衡：等电聚焦后，迅速取出IPG 胶条分别于10 mL 平衡A 液和10 mL 平衡B 液中各平衡15 min；（3） 第二向垂直SDS-PAGE 电泳：将平衡后的IPG 胶条转移至12%的0.75 mm 厚的凝胶上端，使IPG 胶条与凝胶上端紧密贴合，在一端加入低分子量的蛋白质标准品，排尽气泡后，用含痕量溴酚兰的0.8%的琼脂糖封顶。电泳条件为：2.5 W/胶电泳30 min 后以15 W/胶恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳。

1.2.6 考马斯亮蓝染液染色 考马斯亮蓝染液置摇床上染色12 h。染色后的胶条用20%乙醇脱色20～30 min，然后用DDW 水洗2～3 次，每次5～10 min，直至背景清晰为止。

1.2.7 图像分析 Imagescanner 扫描仪扫描考染的凝胶，PD-QUES 图像分析软件依次进行点检测、背景消减，建立平均凝胶，匹配、量化获取斑点的相关信息等分析。斑点位置的重复性按Gorbett 的方法[4]进行计算。所有数据的统计分析在SPSS for Windows 11.0 软件和Excel 上进行.

1.2.8 质谱分析 随机选取并切割分辨较好的蛋白质点于1.5 mL Eppendorf 管中，按本实验室以往方法［3]稍作修改，50%乙腈和50 mmol 碳酸氢氨脱色30 min，水洗数遍直至蓝色消失，乙氰脱水冷冻抽干，5 μL TPCK-Trypsin 冰上吸胀60 min 后37 ℃酶解13 h，覆盖30 μL 萃取液萃取60 min，重复萃取过程2 次，将2 次萃取液收集于0.5 mL Eppendorf 管中，冷冻抽干仪浓缩样品至总体积5 μL 左右。取0.5 μL 样品与等体积饱和基质液CCA 混合，点样于不锈钢板上，空气中干燥。制备好的样品在Voyager-DE STR MALDI-TOF-MS 仪上分析，采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压为20 000 V，反 射 电 压 比 为1.12，N2 激 光 波 长337 nm，脉冲宽度为3 ns，离子延迟提取100 ns，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50 次，质谱使用ATCH 作为外部标准校正，获得肽质量指纹图。

1.2.9 数据库查询 采用Matrix Science 的Mascot软件搜索SWISS-PROT 数据库，搜索条件为：肽片断质量最大误差控制在0.5 Da，酶解片断不完全选择为1 个，物种来源为人类，离子选择 [M+H]+和monoisotopic，固定修饰为半胱氨酸碘乙酰胺化，可变修饰为蛋氨酸氧化，Mascot 配套软件 Mascot Distiller 过滤肽质量峰。

2 结果

2.1 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清差异蛋白质点比较

应用PDQuest 2DE 软件分析双向电泳图，共检测到29 个蛋白质点，双向电泳图重复性好。脑梗死肝阳化风证组与阴虚风动证组血清差异蛋白质点见表1，两组间差异有统计学意义（χ2=9.85，P＜0.05）。脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证其典型的双向电泳图见图1，脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳第1、2 蛋白质点差异点见图2。

表1 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清差异蛋白质点

图1 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证典型的双向电泳图(考染)

图2 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳第1、2 蛋白质点差异点电泳图

2.2 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证MALDITOF-MS 肽质量指纹图分析

从脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证正常人匹配的点中选择29 个分辨清楚的蛋白质点，做好标记，进行MALDI-TOF-MS 分析，并以ACTH 为外标进行校正，共获得了87 张肽质量指纹图。1 号蛋白质点的肽质量指纹图见图3。

图3 脑梗死肝阳上亢蛋白质1 号蛋白质点的肽质量指纹图

2.3 数据库查询结果

用Matrix Science 的Mascot 软件搜索SWISSPROT 数据库图，结果示脑梗死肝阳化风证N 甲基-天冬氨酸蛋白受体、c 反应蛋白、单核细胞趋化蛋白-1、转铁蛋白、血清铜蓝蛋白、S100β 蛋白(S100β)、细胞骨架蛋白等表达上调。脑梗死阴虚风动证糖蛋白、基质金属蛋白酶-9、神经元特异性烯醇化酶、蛋白S、信号传导蛋白等表达上调。脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证主要差异蛋白质点见表2。

表2 脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证主要差异蛋白质点

3 讨论

既往研究认为急性脑梗死患者的发病机制之一是动脉内膜功能紊乱，导致动脉硬化因子增高，激活补体系统，造成血管内膜受损。C 反应蛋白与单核细胞结合诱导组织因子表达，使促凝血过程发生，有报道CRP 水平升高者发生ACI 的几率是正常者的2倍［4］。CRP 同时在脑梗死病理过程中扮演重要角色，脑卒中后2 h 细胞启动炎性介质反应，从而引起CRP 水平表达增高，使病理血管损伤反应增大，加重脑梗死的发展。脑梗死基本病因为动脉粥样硬化，动脉粥样硬化往往导致颈内动脉与椎-基底动脉系统的狭窄和血栓形成，动脉粥样硬化斑块形成更是脑梗死的杀手锏。血管细胞黏附分子是早期巨噬细胞黏附趋化反应的主要参与因素之一，抗炎因素和致炎因素的失平衡状态最终导致了动脉粥样硬化斑块的不稳定。基质金属蛋白酶-9 是一组锌、钙离子依赖性蛋白水解酶家族，是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解和重构的重要介质，存在于正常人体，参与多种生理和病理过程，有助于创伤愈合和血管生成[5]。脑梗死缺血血管痉挛往往与血管内皮生长因子紧密关联。

证候是在致病因素作用下，机体内外环境各系统之间相互关系发生紊乱所产生的综合反应，是反映疾病处于某一阶段病因、病性、病位、病势等病理要素的综合性诊断概念。脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清差异蛋白质点差异有统计学意义。然而脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证为何蛋白质差异点有如此明显区别，可能与如下原因相关：脑梗死肝阳化风证为肝阳亢逆无制而表现动风的证候，可能与细胞炎症介质反应紧密关联，其中与炎性介质反应引起CRP 高水平表达、血管细胞黏附分子参与启动的动脉粥样硬化斑块有关联。阴虚风动证是阴液亏虚，筋脉失于濡养引动肝风的证候，脑梗死阴虚风动证与动脉粥样硬化和炎性介质反应关联因素不大，病因很难确认，与基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等引起的血管痉挛紧密关联。本实验证明了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证其蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态有显著差异，蛋白质组学能对各自证型有典型代表意义。

尽管通过质谱分析和数据库查询，我们所获得的还只是部分蛋白质粗略的功能信息，但是，本实验为一步构建脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清蛋白质表达谱和蛋白质组学数据库提供了有意义的资料，为二者临床与病理进行了深入分析，为寻找可以用于脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证诊断与治疗的相关蛋白质提供了线索。本实验结果仍有待进一部验证。

[1]贾建平.神经内科学（第6 版）[M].北京：人民卫生出版社，2012：175.

[2]金益强.中医肝脏象现代研究与临床[M].北京：人民卫生出版社，2000：237-238.

[3]Corbett J M，Dunn M J，Posch A，et al.Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: an interlaboratory comparison [J].Electrophoresis，1994，15(8-9)：1 205-1 211.

[4]Ma P C，Blaszkowsky L，Bharti A，et al.Circulating tumor cells and serum tumor biomarkers in small cell lung cancer[J].Anticancer Res，2003，23(1A)：49-62.

[5]苗 青，王 菲，周 媛，等.急性脑梗死患者血糖、纤维蛋白原水平与预后关系研究[J].中华全科医学，2009，7（7）：246-247.