黄芪总苷和三七总皂苷配伍对小鼠脑缺血再灌注脑组织能量障碍的影响

2012-11-26 07:42黄小平刘文龙邓常清
湖南中医药大学学报 2012年7期
关键词:单用达拉脑缺血

黄小平,谭 华,刘文龙,邓常清

(1.湖南中医药大学医学院,湖南 长沙410007;2.湖南中医药大学药学院,湖南 长沙410208)

HUANG Xiao-ping1,TAN Hua1,LIU Wen-long2,DENG Chang-qing1

(1.Medical College,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China;2.Pharmaceutical College,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

黄芪和三七是治疗心脑血管疾病的常用中药。药物化学研究表明,黄芪总苷(Astragalosides,AST)是黄芪中具有心脑血管药理作用的主要药效物质,其主要有效成分是黄芪甲苷。三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是三七中具有心脑血管效应的主要药效物质,主要含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1 和三七皂苷R1。临床常将黄芪和三七配伍组成复方用于脑梗死的治疗,且取得了较好效果[1],但传统的生药配伍存在机制不明确、成分不清楚、质量不可控、效应不稳定等缺点。脑缺血后由于脑组织急性缺血缺氧,导致能量代谢障碍,因此,在脑缺血后尽快恢复脑血流,改善脑组织能量代谢,是防止脑组织进一步损伤的重要措施。已有的研究表明,黄芪总苷能改善缺血心肌组织的能量代谢[2],三七总皂苷能明显延缓缺血脑组织ATP 的分解,改善能量负荷[3]。我们前段研究表明,AST 110 mg/kg和PNS 115 mg/kg 分别是抗脑缺血损伤的有效剂量,且两者配伍对氧化应激损伤有协同或相加的效应[4]。因此,为继续探讨AST 和PNS 配伍抗脑缺血的作用机制,从能量代谢水平研究了该有效剂量配伍对脑缺血再灌注障碍的影响,现将实验方法及结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级C57BL/6 小鼠120 只,雄性,质量(20±2)g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,合格证号:SCXK(2009-0004)。饲养于室温20~25 ℃,湿度50%~60%的环境。动物的处理与中华人民共和国科学技术部关于“实验动物的管理和使用指导意见”相一致。

1.1.2 药物及含量 AST 是由豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge 的根中提取而得,购自成都和康药业有限责任公司 (批号HK080302),其含量为45%,原始植物保存于成都和康药业有限公司标本室。AST 用时以0.5%羧甲基纤维素钠配成相应浓度混悬液。

PNS 是由五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen.的主根或根茎中提取的皂苷类成分,购自广西梧州制药(集团)股份有限公司(批号080628),其含量为93.8%,原始植物保存于广西梧州制药(集团) 股份有限公司标本室。PNS 用时以0.5%羧甲基纤维素钠配成相应浓度混悬液。

依达拉奉 (3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,3-Methyl-1-phenyl-2- pyrazolin-5-one),南京先声东元制药有限公司生产,批号80-090104,以生理盐水配成400 μg/mL 溶液。

1.1.3 试剂 超微量Na+-K+ATP 酶测试盒,总蛋白定量测试盒,均购自南京建成生物工程公司。三磷酸腺苷 (ATP)、二磷酸腺苷 (ADP)、一磷酸腺苷(AMP)标准对照品(进口分装)由天津一方有限公司提供。其他试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器 C18-WP 液相柱(产地:上海,型号:Athena);紫外分光光度计(产地:瑞士,型号:VATROPEC4300PRO);高效液相色谱仪(产地:美国,型号:Agilent)。

1.2 方法

1.2.1 药物配伍剂量的确定 根据我们的试验,AST 在30~240 mg/kg 和PNS 在80~320 mg/kg 剂量范围下灌胃给药具有抗小鼠脑缺血的作用,且AST 110 mg/kg 和PNS 115 mg/kg 配伍可以协同抗脑缺血再灌注后脑组织氧化应激损伤[4],故拟定AST 和PNS 的配伍剂量为AST 110 mg/kg+PNS 115 mg/kg。

1.2.2 动物分组及给药方法 将小鼠随机分为假手术组,模型对照组,AST 组(110 mg/(kg·d),ig),PNS组 (115 mg/(kg·d),ig)、AST+PNS 配 伍 组(AST 110 mg/(kg·d)+PNS 115 mg/(kg·d),ig) 及依达拉奉组 (8 mg/(kg·d),ip),每组10 只。依达拉奉组以4 mg/kg 腹腔注射给药(给药体积10 mL/kg),每日2 次;假手术组、模型对照组予0.5%羧甲基纤维素钠10 mL/kg 灌胃,其余各组以相同体积灌胃给药,每日1 次,上午8 点给药,连续4 d。各组在第4 天给药1 h 后造模,术前12 h 禁食。

1.2.3 脑缺血模型的建立 按文献方法[5]制备脑缺血再灌注模型,用动脉夹阻断双侧颈总动脉20 min,再灌注1 h,假手术组也进行同样手术,但不阻断颈总动脉进行脑缺血。于再灌注1 h 后,将小鼠迅速断头,去除小脑及脑干后,脑组织待测。

1.2.4 脑组织腺苷酸含量测定 首先,切得视交叉前冠状脑组织约60 mg,加冷5%高氯酸(脑组织:5%高氯酸=1∶9) 制成10%组织匀浆,4 ℃离心15 min (15 000 r/min),取 上 清 液0.4 mL 加 入3 mol/L 的K2CO30.06 mL,以10% NaHCO3调节pH 至中性,4 ℃离心5 min(3 000 r/min),取上清液进行测定。色谱条件:C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温25 ℃,检测波长254 nm,流速0.7 mL/min,进样量10 μL。流动相:pH 6.0 的100 mmol/L 磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。精密称 取 标 准 品ATP 16.4 mg,ADP 15.0 mg,AMP 13.1 mg,置同一50 mL 的容量瓶中,用流动相溶解、定容,得浓度分别为ATP 328.0 μg/mL、ADP 300.0 μg/mL 和AMP 262.0 μg/mL 的对照品混合溶液。分别吸取1、2、3、4、5 μL 对照品混合溶液,求得标准曲线的回归方程。再取上述处理的样品进样10 μL 并进行色谱分析,根据峰面积计算ATP、ADP、AMP 含量。按公式计算[6]TAN、EC:

TAN=[ATP]+[ADP]+[AMP],EC=([ATP]+0.5×[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])。

1.2.5 脑组织Na+-K+-ATP 酶活性测定 取视交叉后脑组织,加冷生理盐水(脑组织∶生理盐水=1∶9)制备成10%的组织匀浆,4 ℃离心5 min (1 000 r/min),取上清液按定磷法测定Na+-K+-ATP 酶活性,蛋白浓度测定采用考马斯亮兰法。

1.3 统计学分析

2 结果

与假手术组比较,模型组ATP、ADP 含量和TAN 值显著降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,ATP 含量在各治疗组显著升高(均P<0.01),且配伍组比AST 组和PNS 单用组升高更显著 (均P<0.01);与模型组比较,ADP 含量在AST 组、配伍组及依达拉奉组均升高显者(P<0.01,P<0.05),且配伍组ADP 的升高比AST、PNS 单用组更多 (P<0.05,P<0.01);与模型组比较,TAN 值在AST+PNS 配伍组和依达拉奉组显著升高 (均P<0.05);在AST-PNS配伍组和依达拉奉组ATP、ADP 含量和TAN 值差异不显著(均P>0.05)。析因设计方差分析显示AST和PNS 配伍对ATP、ADP 和TAN 有交互作用 (均P<0.01)且配伍组的效应大于单用AST 和单用PNS效应之和,表明AST 110 mg/kg 与PNS 115 mg/kg配伍在抑制ATP、ADP 和TAN 含量降低方面有协同的交互作用。AMP 含量各组间差异均无显著性意义(P>0.05)。

与假手术组比较,模型组EC 值显著降低 (P<0.01)。与模型组比较,各药物组脑组织EC 值显著升高(P<0.05,P<0.01),与AST 组和PNS 单用组比较,AST+PNS 配伍组脑组织EC 值升高显著(P<0.05,P<0.01),EC 值在配伍组和依达拉奉组间没有统计学意义(P>0.05)。析因设计方差分析显示AST 和PNS配伍对EC 有交互作用(P<0.05)且AST+PNS 配伍组的效应约等于单用AST 和单用PNS 效应之和,表明AST 110 mg/kg 与PNS 115 mg/kg 配伍在抑制EC 降低方面有相加的交互作用。

与假手术组比较,模型组脑组织Na+-K+-ATP 酶活性显著降低(P<0.01);与模型组比较,AST+PNS 配伍组、AST 组和依达拉奉组脑组织Na+-K+-ATPase活性显著增强(P<0.05,P<0.01),且AST+PNS 配伍组效应比PNS 组更好(P<0.05)。AST+PNS 配伍组和依达拉奉组间相比较差异没有明显不同(P>0.05)。析因设计方差分析显示AST 和PNS 配伍对Na+-K+-ATPase 有交互作用(P<0.05),且配伍组的效应大于单用AST 和单用PNS 效应之和,表明AST 110 mg/kg 与PNS 115 mg/kg 配伍在抑制Na+-K+-ATPase活性降低方面有协同的交互作用。结果见表1。

表1 各组间小鼠脑组织中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na+-K+-ATP 酶活性的比较 (±s,n=10)

表1 各组间小鼠脑组织中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na+-K+-ATP 酶活性的比较 (±s,n=10)

注:与假手术组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较★P<0.05,★★P<0.01;与AST+PNS 配伍组比较☆P<0.05,☆☆P<0.01。

组 别假手术模 型AST PNS AST+PNS依达拉奉ATP(10-3μg/g 组织)291.3±35.0 125.4±14.2△△171.9±19.6★★☆☆167.5±47.9★★☆☆227.3±15.2★★233.5±39.2★★ADP(10-3μg/g 组织)262.2±52.2 194.3±57.7△248.1±57.0★☆219.6±45.4☆☆285.7±64.7★★263.6±62.7★★AMP(10-3μg/g 组织)596.0±89.3 600.5±52.2 530.2±91.5 585.6±114.8 549.7±77.5 583.3±143.8 TAN(10-3μg/g 组织)1 149.2±99.6 920.1±109.7△△960.2±126.9 972.7±169.7 1 061.7±104.3★1 080.4±183.8★EC 0.37±0.04 0.25±0.02△△0.32±0.02★★☆0.29±0.02★☆☆0.35±0.02★★0.34±0.06★★ATP 酶(μmol.Pi/mg.Pr)4.45±1.49 2.34±0.6△△3.29±0.9★3.03±0.61☆4.08±0.96★★3.38±0.92★

3 讨论

脑是体内能量代谢最活跃的器官,血流量与耗氧量都大,对缺血、缺氧损伤极为敏感。一旦脑血流供应中断,能量耗竭,会立即引起脑功能丧失和脑组织的广泛损伤。

ATP 作为脑组织的主要能量来源,对于维持细胞的生理功能发挥着重要作用。腺苷酸池(TAN)水平和能荷值(EC)是衡量机体、组织和细胞代谢状态的重要参数,TAN 的大小反映了线粒体的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力,EC 是动态反映细胞能量平衡的一个参数[7],可有效评估组织细胞的能量储备状态。能荷值高,说明细胞内ATP 生成活跃,反之则表明ATP 生成不足或利用增加。脑缺血再灌注使脑组织内葡萄糖和氧供应不足,有氧氧化发生障碍,ATP 含量下降,ATP 分解产物ADP、AMP 含量增加,随后ADP、AMP 相继分解,最终导致TAN 水平的变化和EC 值显著下降,从而引起细胞内钙超载、兴奋性氨基酸释放增加、自由基增多以及有氧氧化障碍等[8]。

Na+-K+-ATP 酶催化水解ATP 释放磷酸盐,直接供给自由能。其活性能反映机体能量代谢水平和生理功能状态。脑缺血时,ATP 含量下降,大量自由基产生及兴奋性氨基酸的释放,导致该酶的结构破坏[9],使其功能下降,ATP 生成更趋减少,使原已存在的能量匮乏更加严重,导致ATP 酶活性进一步降低,加重脑损伤[10]。

以往研究证明AST 及其有效成分黄芪甲苷可对抗脑缺血后的氧化应激损伤[11],抑制脑缺血后血脑屏障通透性升高和心肌细胞能量代谢障碍[12,2]。PNS 及其有效成分人参Rg1 有抗脑缺血再灌注后氧化损伤[13]和抑制钙离子超负荷,改善能量负荷的作用[14]。有关AST 和PNS 配伍对脑缺血后脑组织能量代谢的影响还未见研究报道。本研究结果表明,脑缺血再灌注1 h 后,脑组织ATP 和ADP 含量、EC和TAN 值显著下降,Na+-K+-ATP 酶活性降低,说明缺血再灌注后脑组织的能量代谢发生严重障碍,AST 可提高ATP、ADP 含量,EC 值以及Na+-K+-ATP酶 活 性,PNS 可 提 高ATP 含 量,EC 值 和Na+-K+-ATP 酶活性,AST+PNS 配伍组可提高ATP、ADP 含量,TAN、EC 值以及Na+-K+-ATP 酶活性。且AST+PNS 配伍组对ATP、ADP 含量、EC 值和Na+-K+-ATP酶活性的效应比AST 或PNS 单用组效应更好,AST和PNS 配伍在抑制脑缺血再灌注后ATP、ADP 含量,TAN 值的下降方面有协同的交互作用,在抑制EC 值和Na+-K+-ATP 酶活性的降低方面有相加的交互作用。表明AST 和PNS 配伍使用可以协同改善脑缺血后脑组织能量代谢,其机制可能与AST 和PNS 通过抗氧化应激损害和改善脑血流来协同延缓脑缺血后ATP 利用和生成、改善能量负荷、增强Na+-K+-ATP 酶的活性有关。

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