刺齿凤尾蕨抗肿瘤活性成分5F的含量测定Δ

吕应年，侯英奇，范世锦，苟占平1，#（1.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江540；.中央司法警官学院侦查教研室，河北保定 07007；.广东医学院药学院，广东东莞 5808）

刺齿凤尾蕨抗肿瘤活性成分5F的含量测定Δ

吕应年1＊，侯英奇2，范世锦3，苟占平1，3#（1.广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023；2.中央司法警官学院侦查教研室，河北保定 073007；3.广东医学院药学院，广东东莞 523808）

目的：建立测定刺齿凤尾蕨中抗肿瘤成分5F含量的方法，并测定其不同部位中5F的含量。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-1%醋酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0mL·min－1，检测波长为242nm，柱温为30℃。结果：5F检测浓度在6～96μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.9981）；低、中、高浓度对照品加入量对应的平均加样回收率分别为103.33%、100.84%、100.39%，RSD分别为5.86%、3.05%、1.02%（n均为6）。5F在刺齿凤尾蕨叶中含量最高，茎中含量其次，根中含量最低。结论：本方法稳定、快速且杂质干扰小，可用于刺齿凤尾蕨中5F的含量测定。关键词 刺齿凤尾蕨；抗肿瘤成分；Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（5F）；含量测定

刺齿凤尾蕨系凤尾蕨科植物刺齿凤尾蕨Pteris dispar Kunze的干燥全草，具有清热解毒、止血祛痰的功效，民间用于治疗肠炎、痢疾、疮毒[1]。同属植物半边旗（P.semipinnata L.）在分类学上与其比较接近。半边旗有明显的抗肿瘤活性[2，3]，其主要活性成分为二萜类化合物[4，5]，其中最主要的是具有α，β-不饱和环戊酮结构的贝壳杉烷型二萜Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（简称5F）。根据药用植物化学分类学的原理，亲缘关系相近的植物具有相同或相似的化学成分。龚先玲等[6]发现刺齿凤尾蕨的提取物对人癌细胞具有明显的抑制作用；日本学者先前从刺齿凤尾蕨中分离鉴定出一些与半边旗中的活性成分相似或相同的化合物，包括5F[7]；笔者从采自广东韶关的样品提取分离鉴定的化合物中也包括5F（化学成分的分离鉴定另文发表）。为了刺齿凤尾蕨中抗肿瘤活性成分的合理开发利用，本试验建立了以高效液相色谱（HPLC）法测定刺齿凤尾蕨中5F含量的方法，并比较了根、茎、叶片中5F的含量，以为刺齿凤尾蕨的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1200型HPLC仪，含G1311A四元泵、G1328B手动进样器、G1315B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱（美国安捷伦公司）；AE240型电子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；VGT-1860QTD型超声清洗仪（苏州江东精密仪器有限公司）。

刺齿凤尾蕨药材采自广东韶关市乐昌市，经广东医学院苟占平教授鉴定为刺齿凤尾蕨P.dispar Kunze的全草。5F对照品为广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室分离纯化，由日本东京理工大学药学部和广东医学院生化研究所鉴定，并经HPLC归一化法计算纯度＞96%；甲醇为色谱纯，水为三重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）；检测波长：242nm；流动相：甲醇（A）-1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～4min，40%A；4～10min，40%A→60%A；10～17min，60%A→40%A）；流速：1.0mL·min－1；柱温：30℃。

2.2 供试品溶液的制备

分别精密称取3批刺齿凤尾蕨药材的根、茎、叶粗粉各约5g，置于250mL锥形瓶中，各加入甲醇50mL，用保鲜薄膜封口，摇匀，置于超声清洗仪中超声（频率：40kHz，功率：180W）提取60min，摇匀后以定性滤纸滤过，滤液再经0.45μm滤头滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取5F对照品1.2mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为0.12mg·mL－1的对照品贮备液。分别精密吸取该贮备液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mL，以甲醇定容至1mL，摇匀，即得系列对照品溶液。

2.4 系统适用性及专属性试验

分别取96μg·mL－1的对照品溶液和刺齿凤尾蕨根、茎、叶的供试品溶液各20μL，注入HPLC仪，记录色谱图。结果发现，在上述色谱条件下5F的出峰时间为12min，供试品在对照品5F峰相应位置处有一显著色谱峰，表明该色谱系统的适用性和本方法的专属性均良好。色谱见图1。

图1 刺齿凤尾蕨不同部位提取物与对照品的HPLC图A.5F对照品；B.根提取物；C.茎提取物；D.叶提取物Fig 1 HPLC chromatograms of extracts in different parts of P.disparA.5F control；B.extract from roots；C.extract from stem；D.extract from leaves

2.5 线性关系考察

分别精密量取上述系列对照品溶液各20μL，进样测定。以峰面积积分值（Y）对5F的检测浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝14.131X+48.723（r＝0.9981，n＝6）。结果表明，5F的检测浓度在6～96μg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取浓度为72μg·mL－1的对照品溶液20μL，连续进样6次，测定峰面积。结果，RSD＝2.71%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取刺齿凤尾蕨的叶粗粉适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样20μL，测定样品中5F的含量。结果，RSD＝3.16%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量（12μg·mL－1）的同一批刺齿凤尾蕨的叶粗粉适量，共18份，每6份分别加入低、中、高浓度的5F对照品溶液，制备成浓度分别为12、48、84μg·mL－1的供试品溶液，各进样20μL，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝18）Tab 1Results of recovery test（n＝18）

2.9 样品含量测定

分别精密称取3批刺齿凤尾蕨药材的根、茎、叶粗粉各适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取20μL进样，测定峰面积，代入回归方程计算样品中5F的含量，结果见表2。

表2 刺齿凤尾蕨不同部位中5F含量测定结果（n＝3）Tab 2Content determination of 5F in different parts of P.dispar（n＝3）

3 讨论

通过对试验条件的摸索，发现流动相用甲醇-1%醋酸水溶液进行梯度洗脱，可使5F及各成分得到良好分离。因为5F是二萜类酸性化合物，在经过色谱柱时与酸性流动相形成分子状态，故加入醋酸可防止拖尾现象。综上分析，本方法稳定、快速且杂质干扰小，适合刺齿凤尾蕨中5F的含量测定。

从含量测定结果可以看出，5F含量在刺齿凤尾蕨的不同部位相差较大。抗肿瘤活性成分5F主要集中在叶部位，茎中的含量较少，根中含量最低。因此，鉴于资源的合理利用原则，在开发利用刺齿凤尾蕨作为抗肿瘤药用植物资源时，只需利用其地上部分。

[1] 丁恒山.中国药用孢子植物[M].上海：上海科学技术出版社，1982：408.

[2] 张 晓，崔 燎，田中信寿，等.半边旗有效成分及抗肿瘤活性研究[J].中国药学杂志，1997，32（1）：37.

[3] 吴科锋，吕应年，刘 义，等.半边旗提取物5F-Na盐溶液的制备及体外抑癌作用研究[J].中国药房，2010，21（47）：4419.

[4] Chen GG，Liang NC，Lee JF，et al.Over-expression of Bcl-2against Pteris semipinnata L.induced apoptosis of human colon cancer cells via a NF-kappa B-related pathway[J].Apoptosis，2004，9（5）：619.

[5] Liu Z，Ng EK，Liang NC，et al.Cell death induced by Pteris semipinnata L.is associated with p53and oxidant stress in gastric cancer cells[J].FEBS Lett，2005，579（6）：1477.

[6] 龚先玲，苟占平，梁念慈，等.凤尾蕨属6种药用植物抗肿瘤有效部位筛选[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1599.

[7] Murakami T，Tanaka N.Occurrence，structure and taxonomic implications of ferm constituents[M].New York：Wien Springer-Verlag，1988：285.

Content Determination of Antitumor Active Component 5F from Pteris dispar

Lü Ying-nian，GOU Zhan-ping（Guangdong Key Lab for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Guangdong Zhanjiang 524023，China）
HOU Ying-qi（Criminal Investigation Teaching and Research Section，The Central Institute for Correctional Police，Hebei Baoding 073007，China）
FAN Shi-jin，GOU Zhan-ping（College of Pharmacy，Guangdong Medical College，Guangdong Dongguan 523808，China）

OBJECTIVE：To establish an method for content determination of antitumor active component 5F from Pteris dispar，and to determine the content of 5F in different parts.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-1%acetic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0mL·min－1.UV detection wavelength was set at 242nm，and the column temperature was maintained at 30℃.RESULTS：The linear range of 5F was 6～96μg·mL－1（r＝0.9981）.The average recoveries were 103.33%，100.84%and 100.39%，and RSDs were 5.86%，3.05%and 1.02%（n＝6）.The content of 5F in the leaves of P.dispar was the highest，followed by the steam and root.CONCLUSION：The methods is stable，rapid and less interference from impurity，and can be used for the content determination of 5F in P.dispar.

Pteris dispar；Antitumor component；Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid（5F）；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）47-4472-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.47.21

Δ广东省科技计划项目（2009B030801336）；东莞市高等院校科研机构科技计划项目（2008108101050）

＊副研究员。研究方向：天然活性产物。电话：0759-2388405。E-mail：lyn7591@hotmail.com

#通讯作者：教授，博士。研究方向：中药的品种品质。电话：0769-22896599。E-mail：gdzpgou@gdmc.edu.cn

2012-01-09

2012-02-29）