马玲薯葡萄糖培养基在延胡索酸泰妙菌素菌种选育中的应用

马继花，张 萍，石彦鹏，张亚强

(宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究所，银川 750101)

延胡索酸泰妙菌素(Tiamulin Fumarate)是由高等真菌担子菌侧耳属(Pleuroutus mutilus)通过发酵得到截短侧耳素后，再经过化学合成得到的氢化延胡索酸盐，是一种双萜烯类兽用抗生素。本品抗菌谱与大环内酯类抗生素相似，主要抗革兰氏阳性菌，对金黄色葡萄球菌、链球菌、支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪密螺旋体痢疾等有较强的抑制作用，对支原体的作用强于大环内酯类;对革兰氏阴性菌尤其是肠道菌作用较弱。其主要用于防治鸡的慢性呼吸道病、猪支原体肺炎、放线菌性胸膜肺炎和密螺旋体性痢疾等，低剂量可以促进生长，提高饲料利用率。最新研究表明，泰妙菌素与抗肿瘤药物联用可增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，显示了其在肿瘤治疗方面的潜在价值[1]。目前泰妙菌素菌种的生产能力较低，发酵产量低，不能满足发酵行业生产的需要，因此，提高泰妙菌素的产量是生产企业亟待解决的问题，而选育泰妙菌素高产菌株是行之有效的方法。马铃薯葡萄糖培养基是实验室里使用最普遍的真菌培养基，它也被广泛应用于食用菌母菌的培养中[2]。同样作为真菌的担子菌侧耳属的泰妙菌素产生菌，能否在该培养基上生长并体现出它独有的优势，本文以生产用的麦芽浸膏培养基为对照，通过对菌种的分离、筛选以及采用HPLC法测定泰妙菌素的含量，最终获得了4株高于对照的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 菌株TMⅡ10-444由宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究所分离纯化获得。

1.1.2 培养基 平板培养基;麦芽浸膏培养基:葡萄糖、麦芽浸膏、酵母膏、琼脂粉;马铃薯葡萄糖培养基:马铃薯、葡萄糖、琼脂粉;种瓶培养基:葡萄糖、硝酸钙、消泡剂;发酵培养基:葡萄糖、玉米浆、豆油。均参照宁夏泰瑞制药股份有限公司企业内控标准。

1.1.3 试剂 酵母膏和麦芽浸膏，北京奥博星生物技术有限公司;琼脂粉，青岛冻粉厂;玉米浆，华北制药康欣有限公司;硝酸钙、硫酸镁、葡萄糖等均为分析纯试剂。

1.1.4 仪器与设备 Waters2695/2487型高效液相色谱仪，美国Waters公司;C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);XDW25/96 型旋转摇瓶机，乐山长征制药机械有限公司;净化工作台，无锡市荣丰净化空调设备厂;恒温恒湿培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 使用菌株的选择 选择TMⅡ10-444作为出发菌株，用麦芽浸膏培养基进行分离纯化，摇瓶效价为14046 U/mL。

1.2.2 平板培养基的制备 麦芽浸膏培养基:用电子天平(精度0.001 g)准确称取培养基所需量的葡萄糖、麦芽浸膏和酵母膏，加纯化水搅拌使其充分溶解，再加入琼脂粉，并加热溶解至透亮，将溶液倒入量筒中补充纯化水至所需体积，搅拌均匀后分装于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高压蒸汽灭菌30 min，在净化工作台上制备成平板，待用。

马铃薯葡萄糖培养基:取新鲜马铃薯洗净去皮，切块后加纯化水适量煮沸30 min，然后用4层纱布过滤取汁，称取葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素B1微量，逐个用纯化水溶解，再加入琼脂粉，加热溶解并补足体积至1 L，搅拌均匀后分装于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高压蒸汽灭菌30 min，在净化工作台上制备成平板，待用。

1.2.3 稀释平板分离 铲取斜面菌丝，置于加有生理盐水的研磨器中，研磨至混浊、无片状菌丝，吸取菌悬液1 mL，按照10倍稀释法用生理盐水稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，依次涂布于制备的两种不同平板培养基上，工艺条件下置恒温恒湿培养箱中培养3～5 d，观察平板生长情况。

1.2.4 单菌落筛选

1.2.4.1 挑选单菌落 分别挑取两种平板上生长成熟的单菌落接种于麦芽浸膏斜面培养基上，制备成斜面，其中马铃薯葡萄糖平板上挑取单菌落86支，麦芽浸膏平板上挑取单菌落77支，斜面上标注单菌落编号后置于同一培养箱中培养，每日定时观察单菌落的生长情况，并记录生长过程。

1.2.4.2 初筛 以出发菌株在麦芽浸膏培养基上制备的斜面作为对照，将培养好的单菌落斜面对号接入发酵瓶，一支斜面接一个发酵瓶，同时放置同一摇瓶机上，于工艺条件下摇瓶培养，培养结束后取发酵液用甲醇1∶9稀释提取后，测定其HPLC效价。

1.2.4.3 复筛 根据初筛结果从马铃薯葡萄糖培养基中选出8支菌株进行复筛，从麦芽浸膏培养基中挑选出4支菌株进行复筛(以出发菌株在麦芽浸膏培养基上制备的斜面作为对照)，复筛采用二级发酵，一支斜面接一个种子瓶，培养成熟后接入发酵瓶培养基，每个种子瓶平行接三个发酵瓶，连续复筛2批，摇瓶培养，培养结束后取发酵液用甲醇1∶9稀释提取后，测定其HPLC效价。

1.2.5 传代稳定性验证 将保藏的4株单菌落斜面进行传代培养，连续传三代，待斜面培养成熟后进行摇瓶验证。同复筛验证方法，连续验证2批。对照组同1.2.4.3项。比较并分析其相对标准偏差(RSD)值，判断其稳定性。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及个体形态的观察 从不同平板培养基上选择不同类型菌落进行记录，马铃薯葡萄糖培养基平板上长出的菌落表面干燥，外观形态大而疏松，菌丝相互交织，粗而分化，菌落不透明，菌落与培养基之间粘合牢固，较难研磨，培养11～12 d可以挑取单菌落，培养11 d时单菌落外观形态见图1。对照组麦芽浸膏培养基平板上长出的菌落表面干燥，但菌落的外观形态较小而致密，菌丝相互交织，粗而分化，菌落不透明，菌落与培养基之间粘合牢固，比较好研磨，培养13～14 d可以挑取单菌落，培养11 d时单菌落外观形态见图2。

图2 麦芽浸膏培养基平板11 d菌落形态

图1 马铃薯葡萄糖培养基平板11 d菌落形态

2.2 初筛验证结果 从马铃薯葡萄糖培养基平板上挑取86株单菌落，扩培到麦芽浸膏培养基上制成斜面，经摇瓶初筛验证有11株效价高于对照，高效价菌株占总挑选数的12.8%;同时从麦芽浸膏培养基上挑取77株单菌落，扩培到麦芽浸膏培养基上制成斜面，经摇瓶初筛验证有5支效价高于对照，高效价菌株占总挑选数的6.5%。根据初筛验证效价，挑选出马铃薯葡萄糖培养基选育的8支效价较高的菌株 2107、2115、2154、2165、2183、2189、2201、2216和麦芽浸膏培养基选育的4支效价较高的菌株 2253、2262、2283、2289 进行复筛验证。

2.3 复筛验证结果 如表1所示，从复筛效价分析，马铃薯葡萄糖培养基上选育的8支菌株，其复筛验证效价均高于麦芽浸膏培养基上选育的4支菌株，且高于对照组，经过两次复筛摇瓶验证，将2107、2115、2165、2183 共 4 支单菌落斜面用液体石蜡覆盖保藏。

表1 复筛验证结果 U/mL

2.4 筛选菌株稳定性验证结果 从表2中的数据可以得出，2107、2115、2165和2183共4支菌株的第三代传代斜面其验证效价均高于出发株斜面(对照)，而且RSD值较小，说明这4支菌株传代稳定性较好。

表2 稳定性验证结果

3 讨论

3.1 自然选育作为菌种选育中的一种重要手段，具有显著的优势，其操作简单，可通过肉眼观测以及测定发酵产物成分即可选育出效价高的菌株，在工业生产中应用广泛。马铃薯葡萄糖培养基作为常见的真菌培养基，摇瓶验证表明马铃薯葡萄糖培养基适用于延胡索酸泰妙菌素产生菌的生长。通过涂布法将TMⅡ10-444菌株分离在马铃薯葡萄糖培养基和麦芽浸膏培养基上，置于同一生长条件下培养，每天定时观察其生长情况并记录菌株生长过程，马铃薯葡萄糖培养基可以使菌种的生长周期从麦芽浸膏培养基上的14 d缩短到11 d，有效地缩短了选育周期，提高了选育的效率。

3.2 对于生产的菌种而言，其稳定性必须得到保证，马铃薯葡萄糖培养基所选育的菌种传代培养结果显示稳定性表现良好，并且比正常生产的摇瓶效价高，初步表明其可用于生产。

3.3 由于麦芽浸膏在培养基中的用量大、价格昂贵，极大地增加了生产成本;而马铃薯葡萄糖培养基使用的原料主要为马铃薯、葡萄糖等，成本较低，而且选育周期比麦芽浸膏培养基缩短3～4 d，综合比较，马铃薯葡萄糖培养基具有一定的优势，其可以成为延胡索酸泰妙菌素产生菌菌种选育的一种新方法。

[1]邹 懿，黄宇琪，胡昌华.截短侧耳素及其衍生物的研究进展[J].中国抗生素杂志，2009，34(2):65-68.

[2]董洪梅，王新风.PDA培养基的微波灭菌研究[J].北方园艺，2005，(1):71-72.