高效液相色谱法测定鸡鸭羊组织中环丙氨嗪残留量

周 炜，应永飞，韦敏珏，罗成江，朱聪英

(浙江省兽药监察所，杭州 310020)

环丙氨嗪(2-环丙氨基-4，6-二氨基-S-三嗪，cyromazine)，又名灭蝇胺、灭蛆灵、灭蝇药或蝇得净，是一种选择性昆虫生长调节剂，可诱使双翅目幼虫和蛹在形态上发生畸变，使成虫羽化不全或受到抑制。2002年我国农业部批准环丙氨嗪为三类新兽药。通过饲喂方式进入动物体内的环丙氨嗪，绝大部分以原形(约99%)及其代谢产物的形式随粪便排出体外并沉积在粪便中，因而可用于控制动物厩舍内蝇蛆的生长发育，改善畜禽养殖场环境卫生。尽管环丙氨嗪毒性较小，但大量研究表明环丙氨嗪在动物体内的主要代谢产物是三聚氰胺。据Melnick R L等[1]的研究表明，三聚氰胺可导致动物体重下降、肝脏肿大、血液中血红蛋白及血细胞减少、胎儿体重减轻，还可诱导小鼠膀胱肿瘤的形成，可能是一种致癌物质。

我国农业部235号公告规定了:环丙氨嗪在羊肌肉、脂肪、肝、肾中的最高残留限量为300 μg/kg;在禽肌肉、脂肪、副产品中的最高残留限量为50 μg/kg，但对三聚氰胺尚未制订最高残留限量。国内外学者对肉鸡组织、鸡蛋、牛奶、土壤及饲料中环丙氨嗪及其代谢物——三聚氰胺残留量的检测进行了大量研究，但羊组织及禽副产品中环丙氨嗪残留量的检测鲜有报道。已有研究表明，在大鼠、猴、羊、母鸡体内，环丙氨嗪经口服后可被迅速吸收并迅速排泄，其中大于70%的环丙氨嗪以原型存在于排泄物中，三聚氰胺约为15%，氢氧化环丙氨嗪、甲基环丙氨嗪约2%[2]。亦有研究表明:三聚氰胺在动物体富集快，但代谢亦快，在低浓度饲喂猪、鸡时，休药后三聚氰胺即基本代谢完全，残留量极少[3]。因而，结合农业部235号公告，本研究拟不考虑三聚氰胺的残留，仅开展针对羊肌肉、脂肪、肝、肾和禽肌肉、脂肪、副产品中环丙氨嗪残留检测的研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 环丙氨嗪标准品(97.0%)，美国Sigma公司;混合阳离子交换固相萃取柱(MCX，60mg:3mL)，美国Waters公司;Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外检测器)及Agilent化学分析工作站，美国Agilent公司;Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色谱柱、XBridgeTMHILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色谱柱、Atlantis HILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色谱柱，美国 Waters公司;XDB C18(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)色谱柱、RX-SIL(2.1 mm ×150 mm，5.0 μm)色谱柱，美国 Agilent公司。

1.2 标准品溶液 准确称取环丙氨嗪标准品25 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇配成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液;吸取标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 mg/L的标准工作液;吸取适量体积的标准工作液，用流动相稀释含环丙氨嗪为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L的系列标准工作液。

1.3 色谱条件 色谱柱:XBridgeTMHILIC(2.1 mm×150 mm，3.0 μm);检测波长214 nm;流动相为乙腈/25 mmol/L乙酸铵溶液(4∶96，V/V);柱温30 ℃;流速0.3 mL/min;进样量20 μL。

1.4 样品预处理

1.4.1 样品提取 称取(5±0.05)g试料于50 mL离心管中，加入15 mL提取液(乙腈∶1%三氯乙酸溶液，15∶85，V/V)，以 10000 r/min速度匀质1 min，再以5000 r/min离心5 min，收集上清液，然后在残渣中再加入10 mL提取液，同样步骤操作后合并上清液，用30 mL正己烷脱脂一次，收集乙腈相，加入5 mL异丙醇，在50℃水浴中旋转浓缩至1 mL左右，转移至10 mL刻度离心管中，用2 mL提取液淋洗鸡心瓶，合并提取液，待净化。

1.4.2 样品净化 依次用甲醇3 mL和水3 mL活化MCX固相萃取柱，将待净化液上柱，控制过柱速度在1 mL/min以内。用甲醇3 mL、0.1 mol/L盐酸溶液3 mL、水3 mL和甲醇3 mL淋洗固相萃取柱，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱。洗脱液在50℃下氮气吹干，用1.0 mL流动相溶解残渣，涡旋30 s，经0.45 μm滤膜过滤后，上机测定。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化与选择

2.1.1 检测波长的确定 目前，国内外文献中测定动物组织中环丙氨嗪的方法中，测定波长主要为214 nm[4-6]和 230 nm[7]，为了确定最佳检测波长，采用紫外分光光度计对最佳检测波长进行了考察。用甲醇稀释环丙氨嗪标准品至5 μg/mL溶液，照分光光度法测定，所得紫外光吸收图谱见图1。

由图1可知，环丙氨嗪在214 nm波长处有最大吸收，在230 nm波长处吸收值较弱，因此，确定214 nm波长为最佳检测波长。

图1 环丙氨嗪紫外吸收光谱图

2.1.2 液相色谱分离条件的确定 由于环丙氨嗪的极性较强，文献报道采用C18柱和氨基柱作为分析柱。本研究根据魏瑞成等[8]对猪肉中环丙氨嗪残留的提取方法，制备待测组织的提取液，作为阴性基质样本，随后通过基质加标的方法对C18柱、氨基柱及HILIC柱的色谱分离性进行考察。

结果显示，C18柱、氨基柱均无法实现环丙氨嗪与杂质的有效分离。而在HILIC柱条件下，当流动相中乙酸铵溶液/乙腈的比例为96∶4时，能得到较好的分离效果。羊肉样品环丙氨嗪在HILIC色谱柱上的分离效果见图2。

图2 环丙氨嗪在HILIC柱上的高效液相色谱图

2.1.3 干扰试验 考察在HILIC色谱柱条件下其他类似药物对环丙氨嗪分析方法的干扰。环丙氨嗪在畜禽体内主要代谢产物为三聚氰胺，本标准选用三聚氰胺进行了干扰试验，采用环丙氨嗪的色谱条件，三聚氰胺的保留时间为8.9 min，不影响环丙氨嗪的检测，三聚氰胺的色谱图见图3。

图3 三聚氰胺标准品溶液色谱图

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1 样品提取条件的确定 本研究比较了不同提取体积和提取次数下，乙腈/水溶液(95 ∶5、90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20，V/V)以及1%三氯乙酸/乙腈溶液(90 ∶10、85∶15，V/V)对鸡肉组织中环丙氨嗪的提取效能。具体步骤如下:取阴性样本5.0 g，添加环丙氨嗪标准工作液适量，使之成为1.0 mg/kg阳性添加样品，分别用10 mL或15 mL提取液进行提取，重复提取三次，提取液经旋转蒸发浓缩至5 mL左右，经MCX混合阳离子交换柱净化，上机测定，外标法定量。各试验组均重复三次，结果以平均值表示，见表1所示。

表1 提取溶剂选择及用量对环丙氨嗪提取效率的影响

从表1中可见，随着含水量的增加，提取液的提取效率逐渐提高，但是含水量太高时，为后续的浓缩处理增加了难度。三氯乙酸具有明显的沉淀蛋白作用，同时能改变提取环境的酸碱度为酸性，更有利于环丙氨嗪的提取，故具有更好的提取效率。综合考虑后，选用三氯乙酸/乙腈溶液(85∶15，V/V)为提取剂。在提取体积的选择上，发现无论是每次10 mL或15 mL提取液用量，总回收率均高于96%，且前两次的回收率之和均高于94%。考虑到尽量减少溶剂用量和节约时间等因素，本方法采用两次提取，第一次提取溶液用量15 mL、第二次提取溶液用量10 mL，作为样品的提取方法。

2.2.2 浓缩净化条件的确定 目前对于环丙氨嗪的净化方法，主要采用液液分配和固相萃取小柱进行净化，考虑到环丙氨嗪的极性较强，且容易得到质子形成季铵盐的阳离子结构，故本方法采用混合阳离子交换柱进行净化。

由于提取液提取完成后，提取液中含有大量的脂肪等干扰物质，特别是鸡脂肪形成了上下两层，需采用正己烷脱脂除去大部分的脂肪等干扰物质。本方法采用正己烷脱脂的方法，萃取体积为30 mL，脱脂后脂肪层明显减少，而环丙氨嗪因水溶性好而没有明显的损失，回收率稳定。FSIS等方法采用部分提取直接进行SPE净化，但是由于不同基质样品中含水量不同，取固定体积上柱往往会影响到最后的体积系数，回收率不稳定。且由于取部分提取液上柱，也在很大程度上降低了方法检测限，采用高效液相色谱法无法达到鸡组织及副产物最高残留限量中50 μg/kg的要求。故需要先对提取液进行浓缩，取浓缩液全部过柱的方法来提高方法的检测灵敏度。由于提取液中水分比例较高，需对浓缩方法进行研究，比较氮气吹干法和旋转蒸发法的适用性。采用氮气吹干法耗时费力，大大影响检测效率，而旋转蒸发法可通过控制系统真空度的方法，在提高前处理效率的同时保证方法的回收率，故本方法采用旋转蒸发法将样品提取液浓缩至1 mL左右，用2 mL左右提取液淋洗鸡心瓶二次，合并提取液，充分混匀后，在10000 r/min下冷冻(-4℃)离心10 min，取上清液，备用。

本标准的固相萃取条件主要参考FSIS等方法，结合混合阳离子交换柱(MCX柱)的应用条件，建立了以下净化步骤:取5 mL上清液样品转移到经3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX固相萃取柱中，待全部溶液过柱后，再用3 mL甲醇淋洗、3 mL 0.1%盐酸溶液淋洗、3 mL水淋洗和3 mL甲醇淋洗并抽干柱子1 min，最后用5 mL 5%氨水/甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，在50℃水浴中用氮气吹干，加入1.0 mL流动相溶解，过滤膜后进行HPLC分析。

2.3 检测方法的方法验证

2.3.1 标准曲线的建立 配置标准系列工作溶液，使其浓度为 0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mg/L。在上述色谱条件下，依次注入液相色谱仪进行分析，以峰面积y对浓度x(mg/L)作标准曲线，得回归方程:y=411．15x-8．247，R2=0．9999，结果表明:当环丙氨嗪在0.05～5.0 mg/L的浓度范围内时，呈现良好的线性关系。

2.3.2 检测限和定量限的确定 农业部235号公告规定，羊肌肉、脂肪、肝、肾中环丙氨嗪的最高残留限量为300 μg/kg，而禽肌肉、脂肪、副产品中的最高残留限量为50 μg/kg。为了满足这个要求，采用空白样品中添加浓度25 μg/kg环丙氨嗪的方法进行试验，考察方法的检测限和定量限。经回收率试验，当动物组织中添加环丙氨嗪为25 μg/kg时，信噪比(S/N)大于10;当动物组织中添加环丙氨嗪为10 μg/kg时，信噪比(S/N)大于3。所以，本方法将动物性食品中环丙氨嗪残留检测的方法定量限确定为 25 μg/kg，检测限确定为 10 μg/kg，完全能满足实际样品检测的需要。

2.3.3 方法的回收率和精密度 根据我国农业部235号公告的规定:羊肌肉、脂肪、肝、肾组织中环丙氨嗪的最高残留限量为300 μg/kg，禽肌肉、脂肪中环丙氨嗪的最高残留限量为50 μg/kg，因而初定对25、50、100、300、600 μg/kg 五种空白添加浓度进行方法学考查，不同组织的具体添加浓度及回收率数据见表2。

表2 不同动物组织中环丙氨嗪回收率试验 %

续表

续表

从回收率结果看出，羊肉、羊肝、羊肾和羊脂肪在25～600 μg/kg添加浓度范围内，回收率为74.4% ～107%，批内RSD在0.9% ～11.9%之间，批间RSD在0.3% ～11.1%之间。鸡肉、鸡肝、鸡脂肪和鸭肉在25～600 μg/kg添加浓度范围内，回收率为74.9% ～101%，批内 RSD在1.9% ～10.7%之间，批间RSD在1.2% ～7.1%之间。由此可见回收率满足通常70% ～120%的规定，批内RSD＜15%，批间RSD＜20%，说明本方法能满足动物性食品中环丙氨嗪测定的需要。

2.3.4 实际样品检测 在本实验设定的检测步骤和仪器条件下，对日常监测和市场抽查的15例羊组织(肌肉、脂肪、肝脏)以及26例禽组织(鸡肉、鸭肉、鸡脂肪、鸭肝)进行了检测，均未发现环丙氨嗪残留。

3 结论

研究建立了禽、羊可食性动物组织中环丙氨嗪残留检测方法，采用三氯乙酸/乙腈提取，经MCX固相萃取小柱净化后，上机检测，外标法定量，检测限为10 μg/kg，定量限为25 μg/kg。提取效果好，回收率在74% ～107%之间，批内RSD为0.9～11.9%，批间RSD为0.3% ～11.1%，能充分满足动物性食品中环丙氨嗪检测的需要，可为该药物的监控提供技术支持和保障，对保证国际之间正常贸易往来以及保障人类健康，具有十分重要的意义和实用价值。

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