高效液相色谱法同时测定鱼肉中四种喹诺酮类药物残留

唐 巍，卢艳芬，丑亚琴，冯亚玫，徐丽君，杨 辉

(长沙市畜禽水产品质量检测中心，长沙 410013)

恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星均属于氟喹诺酮类药物(quinolones，QNs)，是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的人工合成抗菌药物，其抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，价格低廉，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业。不当使用该类药物会造成水产品中药物残留，易诱发细菌耐药性，严重时甚至引起食用者产生远期毒性作用及潜在“三致(致癌、致畸、致突变)作用”[1-2]。因此，此类药物的残留问题越来越引起人们的关注。目前，用于QNs残留的检测方法有微生物法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)等[3-13]。本研究旨在利用高效液相色谱-荧光检测器对鱼肉中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留进行同时检测，改进前处理方法和优化色谱条件，建立起一种简便、快捷、准确，同时可满足我国现行兽药残留检测分析要求的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters e2695高效液相色谱仪(配有Waters2475型荧光检测器和Empower2色谱工作站)，美国Waters公司;GM200型均质研磨仪，德国Retsch公司;MS3 basic型旋涡混合器，德国IKA公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;PL602-S型电子分析天平、AG285型电子分析天平，Mettler Toledo公司;PHSJ-4A型pH计，上海雷磁公司;Heraeus Multifuge X1离心机，Thermo公司;超纯水器，美国Millipore公司;Oasis HLB固相萃取柱(3cc，60mg)，美国Waters公司。标准品:氧氟沙星(99%)、诺氟沙星(99%)、恩诺沙星(99%)、环丙沙星(99%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈(色谱纯)，德国Merck公司;四丁基溴化铵、磷酸(均为分析纯);氨水(纯度25%)。

1.2 标准溶液配制 分别准确称取标准品各10.0 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，于-20℃条件下保存。使用时取一定体积的上述标准储备溶液混合，用流动相稀释成质量浓度为0.002、0.005、0.025、0.05、0.5 μg/mL 的标准工作液。

1.3 色谱条件 色谱柱为Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm，5μm);柱温40℃;流动相为乙腈/7 mmol/L四丁基溴化铵溶液(磷酸调 pH 3.0)体系，体积比为6∶94;流速为1.0 mL/min;6.0 min前荧光检测器激发波长283 nm、发射波长490 nm，6.0 min后激发波长280 nm、发射波长450 nm。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品制备 鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉，经组织匀浆机均质，于-20℃冰箱冷冻贮存，分析前取出置室温解冻。

1.4.2 提取 准确称取(5.00±0.05)g样品，置于50 mL离心管中，加入10.0 mL四丁基溴化铵溶液(7 mmol/L，pH 2.0)，漩涡混匀 1min，再超声 20 min，5000 r/min离心10 min，上清液全部转移至另外一只离心管中。将残渣重复上述步骤提取一次，合并上清液，11000 r/min离心5 min，上清液即为样品提取液。

1.4.3 净化 将固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL四丁基溴化铵缓冲液(7 mmol/L，pH 1.0)活化，取2.0 mL样品提取液过柱，自然流干，再先后加入3 mL四丁基溴化铵缓冲液(7 mmol/L，pH 1.0)和2 mL 5%甲醇水淋洗。3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，45℃氮气吹干，用1 mL流动相复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离 在1.3项色谱条件下，分析得到标准溶液、空白和加标鱼肉样品的色谱图，见图1～图3。从图1、图2可知，在所采用的色谱条件下，分析物可以得到很好的分离，未发现杂质峰的干扰。

2.2 线性范围与检测限 配制一系列浓度的氟喹诺酮类标准混合溶液(0.002～0.5 μg/mL)，在上述色谱条件下进行测定，以各组分质量浓度与其色谱峰面积进行线性回归，得到的线性回归方程见表1，呈良好线性关系。考虑到实际工作中样品基质较为复杂，为减少杂峰的干扰，选用10倍信噪比(S/N)计算检出限，诺氟沙星、氧氟沙星检出限为1 μg/kg，环丙沙星、恩诺沙星检出限1.5 μg/kg。同时，根据加标实验情况(图4)定量限以及四种组分同时测定的要求，确定诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的定量限均为4 μg/kg。

表1 方法的线性范围、线性回归方程、相关系数和检测限

图4 加标鱼肉样品色谱图(4 μg/kg)

2.3 回收率和精密度 分别对草鱼、鳙鱼、大黄鱼加标，测定加标回收率和方法的精密度。测定结果显示:四种氟喹诺酮在三种样品中的平均回收率在68.5% ～106.6%之间(表2)，相对标准偏差在0.80% ～9.16%之间(表3)，说明方法的前处理提取效率和准确度满足分析要求。

表2 方法的回收率

表3 方法的精密度

2.4 样品提取溶剂的选择 样品前处理过程中提取剂的提取能力有很大差异，常用的有酸化乙腈[14]、磷酸盐缓冲溶液[8]、二氯甲烷[15]等。本研究分别比较了四丁基溴化铵溶液、酸化乙腈、磷酸盐缓冲溶液3种提取溶剂的提取效果，综合比较提取效率，同时考虑有机溶剂的使用对环境造成的影响，决定采用四丁基溴化铵溶液作为提取溶剂，并进行优化。还比较了不同pH值的四丁基溴化铵溶液 (pH=1、2、3)的提取效果，结果发现，选用pH值为2的四丁基溴化铵溶液作为提取液，能够有效提高回收率，降低杂质干扰(表4)。

表4 提取液pH值对提取效果的影响

2.5 色谱柱的选择 对于氟喹诺酮类药物的HPLC分析近年来一般采用C18等反相色谱柱[8-9，16]。不同型号的色谱柱因为其键合工艺和填料方法的不同，同样条件下分析同样物质会有不同的色谱行为。本研究考察了Agilent TC-C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)、Agilent XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)和 Werters Atlantis T3(150 mm×4.6 mm，5μm)三款色谱柱。经比较，Werters Atlantis T3(150 mm ×4.6 mm，5μm)色谱柱在峰型对称性和分离度方面都明显优于前两者。

2.6 检测波长的优化 对于氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的检测一般都采用激发波长280 nm、发射波长 450 nm 的荧光检测条件[8，16-17]，但氧氟沙星在激发波长280 nm、发射波长450 nm条件下，峰响应值相对较小，将影响该组分的检测下限。因此，在检测中考虑变换波长，在诺氟沙星出峰之前采用激发波长283 nm、发射波长490 nm的检测波长，实验证明氧氟沙星的峰响应值明显提高(图5)。

图5 氟喹诺酮类药物标准品检测波长变换色谱图对比(250 ng/mL)

3 结论

本研究采用四丁基溴化铵溶液提取、Oasis HLB固相萃取柱净化，建立了水产品中4种喹诺酮类药物残留的高效液相色谱-荧光

检测测定方法。该方法简便、快速、精密度高，重现性好，检出限低，能满足我国现行兽药残留检测分析的要求，可用于鱼类中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星药物残留的定量分析检测。

[1]刘 双，杨京华.喹诺酮类药物研究进展[J].临床药物治疗杂志，2007，5(6):39-42.

[2]郭少忠，吴晓君.浅谈渔药喹诺酮类[J].海洋与渔业，2008，(7):17-20.

[3]孙建华，王庆贺，郭 霞，等.水产品中环丙沙星检测技术的研究进展[J].水产科技情报，2009，36(4):189-194.

[4]宓晓黎，黄丽俊.食品中喹诺酮类兽药多残留检测技术的应用与发展[J].中国兽药杂志，2011，45(1):33-37.

[5]农业部1025号公告-8-2008.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测酶联免疫吸附法[S].

[6]Mostafa S，Ei-sadek M，Alla E A.Spectrophotometric determination of enrofloxacin and pefloxacin through ion-pair complex formation[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2002，28(1):173-180.

[7]El-kommos M E，Saleh G A，Ei-gizawi S M，et al.Spectrofluorometric determination of certain quinolone antibacterials using metalchelation[J].Talanta，2003，60(5):1033-1050.

[8]赵思俊，李 存，江海洋，等.高效液相色谱检测动物肌肉组织中7种喹诺酮类药物的残留[J].分析化学，2007，35(6):786-790.

[9]彭 涛，雍 炜，安 娟，等.反相高效液相色谱/质谱法同时测定鸡肉中5种喹诺酮药物残留[J].分析化学，2006，34(增刊1):10-14.

[10]陈雪昌，郑代明，金彩杏.高效液相色谱法同时测定水产品中盐酸环丙沙星和恩诺沙星残留量[J].中国科技信息，2005，(14):16-17.

[11]农业部783号公告-2-2006.水产品中诺氟沙星、盐酸环丙沙星、恩诺沙星残留量的测定液相色谱法[S].

[12]孟 勇，吴光红，朱晓华.RP-HPLC同时测定中华绒螫蟹肝脏中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留[J].中国水产科学，2005，12(6):772-778.

[13]GB/T 20751-2006.鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].

[14]张健玲，张勇清，黄慧贤.HPLC法测定鳗鱼中三种喹诺酮药物残留[J].中国食品卫生杂志，2008，20(4):316-318.

[15]Bailac S，Ballesteros O，Jimenez-lozano E，et al.Determination of quinolones in chicken tissues by liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection[J].Chromatogr A，2004，1029(1/2):145-151.

[16]惠芸华，张晓玲，金高娃.高效液相色谱法测定水产品中9种氟喹诺酮类药物残留[J].海洋渔业，2010，32(2):204-210.

[17]钱卓真，苏秀华，魏博娟.高效液相色谱法同时测定水产品中6种喹诺酮药物的残留[J].食品科学，2010，31(6):185-189.