大肠杆菌 K88、K99、987P纤毛抗原提纯及抗血清制备

熊媛媛，黄 涛，郑 佳，漆世华，谢红玲，吴玉石

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起幼龄家畜腹泻的主要病因之一[1]，而其致病作用与黏附性纤毛和肠毒素密切相关。ETEC菌株是通过细菌的纤毛与宿主小肠上皮细胞表面的相应受体结合，从而在该局部组织黏附、定居、繁殖和产生毒素，导致腹泻[2]。引起仔猪腹泻的纤毛抗原主要是K88、K99、987P和F41[3]。纤毛抗原具有良好的免疫原性，免疫机体后能产生相应的纤毛抗体，对产肠毒素大肠杆菌具有免疫作用。由于幼畜起病早、发病快，应利用纤毛抗原免疫怀孕母猪，产生特异性纤毛抗体，仔猪可通过被动免疫途径获得保护。

仔猪黄痢是由致病性大肠杆菌引起出生仔猪发生的一种急性、高度致死性肠道传染病。目前国内外有关预防仔猪大肠杆菌病(仔猪黄痢)的疫苗报道较多，以灭活疫苗和基因工程苗为主。国内已获批准的有K88、K99双价基因工程苗，全菌苗为用K88、K99、987P菌株研制的仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗。为生产高效特异性疫苗，必须进行K88、K99、987P纤毛的纯化，抗血清制备及纤毛抗原的定量检测工作。本研究旨在纯化纤毛抗原，制备高效价、高特异性的 K88、K99、987P抗血清，为K88、K99、987P菌株的鉴定及纤毛抗原的定性和定量测定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基、试剂 大肠杆菌 C83549(O149:K88ac)、C83644(O68:K99)、C83710 菌株(O9:987P)由中国兽医药品监察所鉴定和供应。改良Minca汤培养基，由北京中海生物科技有限公司提供。K88、K99、987P单因子血清由中国兽医药品监察所提供。BCA蛋白定量试剂盒，Thermo Scientific;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma。

1.2 细菌培养 细菌用相应的K88、K99、987P单因子血清做平板凝集反应，达到强阳性反应，然后接种改良Minca肉汤培养基，37℃振荡过夜培养16～20 h;菌液离心，收集菌泥，用1/10原菌液量的0.01 mol/L pH 7.2 PBS重悬。

1.3 纤毛提纯

1.3.1 K88、K99纤毛提纯 将浓缩后的菌液55～62℃加热20～30 min，期间不断摇晃;15000 g离心30 min，取上清;加入固体硫酸铵至饱和度为30%，4℃放置过夜;15000 g离心30 min，收集沉淀，用少量0.01 mol/L pH 7.2 PBS悬浮，透析;进行SDSPAGE电泳，检验K88、K99纤毛提纯的效果;BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。检测方法参考试剂盒中提供的使用说明。

1.3.2 987P纤毛提纯 将浓缩后的菌液55～62℃加热20～30 min，期间不断摇晃;15000 g离心30 min，取上清;加入固体氯化钠使其终浓度为1 mol/L，4℃放置1 h;15000 g离心30 min，收集沉淀，用少量0.01 mol/L pH 7.2 PBS悬浮、透析;进行SDS-PAGE电泳，检验987P纤毛提纯的效果;BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。

1.4 纤毛扫描电镜观察 将纯化的纤毛抗原在经Formvar膜包被的铜网上负染，电镜观察(K88、K99，FEI Tecnai G220 TWIN;987P，HITACHI H-7000FA)。

1.5 抗血清制备 选择体重1.5～2.0 kg的健康家兔，用0.01 mol/L pH 7.2 PBS将纯化的纤毛抗原稀释为蛋白质浓度0.5 mg/mL，与等量弗氏完全佐剂混合制成乳剂，作为首次免疫抗原，腿部肌肉多点注射，2 mL/只。2周后，用同样的抗原与等量弗氏不完全佐剂混合制成乳剂，作为二次免疫抗原，注射方法与剂量同首次免疫。再过2周，以1 mg/mL浓度的抗原加弗氏不完全佐剂制成乳剂，进行三次免疫，注射方法与剂量同首次免疫。用琼脂扩散试验检测血清效价，待血清琼扩效价达1∶32以上时，心脏采血，分离血清，经56℃水浴灭活30 min，加0.01%硫柳汞，置-40℃保存。

1.6 血清效价测定 采用琼脂扩散试验对所制备的K88、K99、987P抗血清进行效价的测定。用0.01 mol/L pH 7.2 PBS配制1%琼脂糖凝胶，加0.01%硫柳汞，用平板制成3 mm厚的凝胶板，用梅花打孔器打孔。在中央孔加满纯化的纤毛抗原，外周孔加满相应不同稀释度的抗血清，稀释倍数依次为 8、16、32、64、128;并用相应的K88、K99、987P单因子血清作为阳性对照，置25℃湿盒内扩散24～48 h，观察结果。

2 结果

2.1 纤毛抗原纯化 SDS-PAGE电泳显示，纯化的K88、K99、987P纤毛为高纯度的纤毛抗原，目的蛋白分子量分别约为26、18、20 kD(图1)。

图1 纤毛抗原纯化的SDS-PAGE结果

2.2 纤毛抗原的电镜观察 电镜负染观察，纯化的K88纤毛为柔软丝状的结构特征;K99呈微丝样结构;987P纤毛可见纵横交错排列、刚硬的结构特征(图2)，三种纤毛均有强烈的聚集倾向，这与之前的报道[4-6]是一致的。

图2 大肠杆菌K88、K99和987P纤毛形态

2.3 血清效价的测定 琼脂扩散试验测定了K88、K99、987P 抗血清的效价，依次为 1 ∶32、1∶32、1∶128。抗血清及相应纤毛抗原之间出现单一沉淀线，且沉淀线与阳性对照的沉淀线相连(图3)，而不与其他纤毛抗原出现沉淀线。因此所制备的K88、K99、987P抗血清均具有高特异性。

图3 抗血清琼扩效价的测定结果

3 讨论

3.1 纤毛表达量 试验中发现大肠杆菌K88的纤毛表达量一直很稳定，但从冻干菌种复苏的大肠杆菌K99、987P的产纤毛量很少，因此获得能够稳定且高表达纤毛的大肠杆菌非常重要，可通过玻板凝集试验检测纤毛的表达量。大肠杆菌987P在胰蛋白胨大豆培养基(TSA/TSB)中传代几次，987P纤毛的表达量大大提高。纤毛表达量除了与菌株本身的特性有关外，还与培养基、温度等因素有关[7]。

3.2 纤毛抗原的纯化 得到高纯度的纤毛抗原是本试验的关键。目前，常用的脱纤毛方法有两种，即加热法和高速匀浆法。同时采用这两种方法，使脱纤毛更加完全[8]，即先采用55～62℃加热20～30 min，再用高速匀浆法脱纤毛。加热后80%以上的纤毛已从菌体上脱落，而高速匀浆仅能使较少的纤毛脱落，这与 de Graaf等[9]报道一致。另外，经高速匀浆处理后，含有更多的杂蛋白，可能与高速匀浆导致菌体破碎有关。

热脱后的K88、K99纤毛抗原经硫酸铵沉淀，可获得较纯的目的蛋白。试验中比较了不同饱和度硫酸铵沉淀纤毛的效果，结果表明，硫酸铵饱和度为30%时，纤毛蛋白沉淀完全且纯度高，随着饱和度的增加，杂蛋白增多，该结果与文献[10]所述一致。同时试验比较了三种方法来纯化987P纤毛，分别为硫酸铵盐析、等电点法[4]、氯化钠盐析。结果表明，经1 mol/L NaCl处理，目的蛋白全部沉淀下来，且无杂蛋白，方法简单且省时;等电点法纯化效果好，但非常费时费力;硫酸铵盐析存在少量杂蛋白。因此，选用氯化钠盐析纯化987P纤毛。

3.3 纤毛分子量 本试验提纯的K88纤毛的分子量大小约为26 kD，这与李虹等[8]报道的25 kD基本一致。关于K99纤毛分子量的大小，文献报道存在一定的差异。de Graaf等[9]测出的分子量为18.5 kD，Karkhanis等[11]测出的分子量大小为17 kD，朱良全等[12]报道的为18 kD，这些与本试验提纯的K99纤毛分子量(约18 kD)接近。Altmann等估算其分子量大小为12.3～12.9 kD[5]及13 kD[13]。Isaacson[6]报道 K99 纤毛由两个亚单位组成，分子量为22.5 kD占多数，还有少数分子量为29.5 kD。

根据聚丙烯酰胺的浓度和巯基乙醇存在与否，987P的分子量的大小是可变的[14]。在5%聚丙烯酰胺条件下，有巯基乙醇时存在两条带，主要条带分子量为20 kD，还有少部分分子量为26.5 kD;无巯基乙醇时分子量为20 kD;在11%聚丙烯酰胺条件下，有无巯基乙醇，其分子量分别为22 kD和19.4 kD。相同纤毛蛋白其分子量差异的原因，可能与菌株、环境有关，具体原因还未见相关文献的报道。

3.4 纤毛抗血清 本试验得到的K88、K99、987P抗血清的琼扩效价依次为 1∶32、1∶32、1∶128。K88、K99抗血清的效价较低，是否可通过调整免疫程序，如从免疫途径、接种剂量、免疫时间等方面来提高抗体的效价，还有待尝试。特异性抗血清的制备为K88、K99、987P纤毛抗原定量检测及产纤毛大肠杆菌菌株的鉴定奠定了基础。

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