鹅源坦布苏病毒的分离及初步鉴定

2012-11-23 07:07施少华傅光华万春和程龙飞陈红梅黄振洲
中国兽医杂志 2012年12期
关键词:尿囊生理盐水日龄

施少华,傅光华,万春和,程龙飞,陈红梅,黄振洲,黄 瑜

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建 福州350013;2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建 福州350013;3.广东省江门市台山都斛西敦兽医服务部,广东 江门529226)

2010年春夏之交,我国部分地区种鸭和蛋鸭发生以突发产蛋急剧下降为特点一种疾病。研究人员从表现产蛋骤降的病死禽中采集其卵巢、肝脏、脑等进行病毒分离,经对所分离的病毒进行形态学观察、理化特性测定、RT-PCR检测及序列分析明确该病病原为坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)[1-6]。之后相继有鸡和鹅感染TMUV的病例报告[7-9]。

2011年5~6月,广东江门的部分养鹅场20~30日龄雏鹅发病,临床症状主要表现为摇头、软脚,剖检可见肝脏出血、坏死,个别有心肌出血等现象。我们从患病鹅中分离到1株病毒,经RT-PCR检测和序列分析表明该病毒为TMUV。

1 材料与方法

1.1 酶、试剂 Trizol reagent RNA提取液,购自Invitrogen公司,反转录酶AMV Reverse Transcriptase、RNA酶抑制剂 Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mix、DNA Marker DL-2 000和pMD18-T载体,均购自宝生物工程(大连)有限公司,2×PCR Master Mix,购自Fermentas公司,琼脂糖凝胶回收小量试剂盒、质粒小量抽提试剂盒,购自Omiga公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞自制。

1.2 试验禽胚、试验动物及血清 13日龄鹅胚,购自广东江门某孵化场,10日龄番鸭胚购自福建莆田某孵化场。3日龄长乐灰鹅,购自福建长乐某养鹅场。抗鸭TMUV血清由鸭TMUV WR株免疫麻鸭制得。

1.3 病原分离 无菌采集呈典型病变的雏鹅肝脏,处理后接种于血琼脂平板培养基,于37℃有氧或烛缸培养48h,观察有无细菌生长。同时将雏鹅的肝脏剪碎后按照组织重量1∶4加入灭菌PBS,反复冻融3次后8 000r/min离心5min,取上清用0.22μm的过滤器除菌,滤过液经尿囊腔接种13日龄鹅胚6枚,0.2mL/胚;同时接种灭菌PBS作为对照。每天观察3次,弃24h内死胚。收集24~120h死亡鹅胚的尿囊液,进行无菌检查和鸡红细胞凝集试验后,-20℃保存备用。

1.4 病毒在番鸭胚的传代 将鹅胚的尿囊液接种10日龄番鸭胚4枚,0.2mL/胚;同时接种灭菌PBS作为对照。每天观察3次,弃24h内死胚,收集24~96 h死亡鸭胚的尿囊液,进行无菌检查和鸡红细胞凝集试验后,-20℃保存备用。

1.5 鸭胚半数致死量(ELD50)的测定 将待测病毒液用灭菌生理盐水作10-1~10-6稀释,分别接种于10日龄番鸭胚尿囊腔中,每个稀释度接种5枚,每枚0.2mL。每天照蛋2次,24h内死亡的鸭胚废弃不计,以后每天记录死亡情况,连续观察7d,按Reed-Muench法计算病毒对番鸭胚的ELD50。

1.6 中和试验 将新鲜病毒尿囊液按1∶10稀释,与已知的抗鸭TMUV血清等量混合,并用1∶10病毒液与灭菌生理盐水等量混合作对照。混合后置37℃1h,分别接种10日龄鸭胚,每枚0.2mL,每组5枚。每天观察3次,弃24h内死胚,共观察7d。

1.7 动物回归试验 将20只3日龄长乐灰鹅随机分成2组,每组10只。饲养观察7d后,A组肌肉注射新鲜病毒尿囊液,每只1mL,B组肌肉注射灭菌生理盐水,每只1mL。隔离饲养,每天观察2次,连续观察14d。

1.8 RT-PCR鉴定及序列分析

1.8.1 引物设计与合成 参照文献[10]合成可扩增469bp的鸭TMUV NS5基因片段的引物,由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.8.2 RNA提取及反转录 取病毒株感染的番鸭胚尿囊液于10 000r/min(4℃)离心10min以去除杂质,收集上清液参照Trizol reagent说明书操作对病毒RNA进行提取,最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5μL DEPC水溶解。反转录按AMV Reverse Transcriptase说明书进行,具体如下:将制备好的RNA 5μL,加入200pmol/μL随机引物1μL,AMV RT 5×Buffer 4μL,2.5mmol/L dNTP Mixture 8μL,40U/μL Ribonuclease Inhibitor 1μL,AMV Reverse Transcriptase 1μL,混匀后按以下程序进行RT:42℃60min,99℃5min,保存于4℃。

1.8.3 PCR扩增 PCR反应体系为25μL:取2μL反转录产物,2× PCR Master Mix 12.5μL,上、下游引物各1μL,dd H2O补齐至25μL后按以下程序进行PCR:95℃变性3min后,94℃变性40s,55.3℃退火40s,72℃延伸40s,共35循环,最后72℃延伸10 min,保存于4℃。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8.4 其他病原的排除 参照禽流感病毒、禽1型副黏病毒、鹅细小病毒、鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒、新致病型鸭呼肠孤病毒基因序列设计引物,提取GD06株病毒的核酸,分别进行PCR或RT-PCR扩增。

1.8.5 克隆测序 PCR产物回收纯化后连接到pMD18-T载体,转化入DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12~16h,挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、200r/min振荡过夜,取2μL菌液进行PCR鉴定,结果阳性者送至上海英骏生物技术有限公司测序。

1.8.6 序列比对分析 将所获得的测序结果用DNAStar软件包MegAlign程序进行比对,并通过MEGA 4.0分析遗传进化关系。参考毒株及其登录号:JS804株(JF895923),BYD-1株(JF312912),SD株(JN232077),Huabei株(JF523187),TMUV 14/6/82株(EU303233),以色列火鸡脑膜炎病毒(Israel turkey meningoencephalitis virus,ITV)(AF013377)。

2 结果

2.1 病原分离 从病死鹅肝脏取样接种于血琼脂平板,37℃培养后48h未发现有细菌生长,初步排除细菌感染的可能。病料样品接种鹅胚后在72h左右死亡,收集死亡鹅胚的尿囊液,经检验无细菌污染和病毒无血凝活性,暂命名为GD06株。

2.2 ELD50的测定 将待测病毒液用灭菌生理盐水作10-1~10-6共6个稀释度,分别接种于10日龄番鸭胚尿囊腔中,连续观察7d,算出ELD50=10-1.84/0.2mL。

2.3 中和试验 将新鲜病毒尿囊液按1∶10稀释,与已知的抗鸭TMUV血清等量混合,置37℃1h,接种鸭胚,第3天有死胚1枚,而1∶10病毒液与灭菌生理盐水等量混合后接种鸭胚,7d内全部死亡。

2.4 动物回归试验 A组肌肉注射新鲜病毒尿囊液后死亡2只,剖检鹅肝脏有出血、坏死,将病变组织匀浆后接种10日龄鸭胚,可致鸭胚死亡,用RT-PCR检测结果为阳性,扑杀其他健活鹅未发现有明显的剖检病变。B组肌肉注射灭菌生理盐水无异常现象。

图1 鹅TMUV GD06株的RT-PCR/PCR检测

2.5 RT-PCR或PCR鉴定 用特异性引物对GD06株进行扩增,产物的电泳结果见图1。如图1所示,鸭TMUV特异性引物能成功扩增出1条约500bp的电泳条带,且空白对照无特异性条带。其他特异性引物均未能成功对其扩增出目的片段。

2.6 基因序列分析 将所扩增的目的片段进行回收纯化、克隆测序,经BLASTP检索可知,所克隆的基因片段与TMUV具有较高的同源性。对所获序列进行比对,结果见表1,分离株GD06与鹅源TMUV JS804株的核苷酸同源性高达99.8%,与鸭源TMUV(WR株、BYD-1株和SD株)核苷酸同源性分别为99.1%、99.8%和99.8%;与鸡源TMUV FQ-C1株的同源性高达98.5%,而与TMUV 14/6/82株的同源性为88.3%,与ITV的同源性为76.1%(TMUV与ITV的同源性则为74.4%);氨基酸同源性比较表明,GD06株与BYD-1株、SD株、JS804株和Huabei株的同源性达100%,与鸡源TMUV FQ-C1株的同源性为98.1%,与TMUV的同源性也达96.8%。如图2所示,GD06株与鸭源、鹅源和鸡源TMUV的遗传进化关系近,它们共聚为同一分支,但与TMUV和ITV分立不同的进化分支。

3 讨论

黄病毒是一类具有囊膜的单链RNA病毒,包括黄热病病毒、乙型脑炎病毒、登革热病毒、坦布苏病毒、森林脑炎病毒、以色列火鸡脑膜炎病毒等。吸血的节肢动物,例如蚊和蜱等是黄病毒属的主要传播媒介。

表1 水禽源TMUV毒株之间及其与TMUV和ITV参考毒株之间NS5基因的同源性

图2 基于TMUV NS5基因构建的进化树

本试验自表现神经症状、软脚的病死鹅脏器中分离到病毒GD06株,经对分离的病毒株进行RTPCR鉴定及序列分析表明,初步确定GD06株病毒为TMUV。ELD50的测定结果显示,GD06株的毒力较低,进行血清中和试验时0.2mL的病毒液无法达到200ELD50的毒价,所以仅能进行简单的定性中和试验,其结果说明GD06株病毒与鸭TMUV抗原相关性强,动物回归试验也证明GD06株毒力弱。

序列分析表明,分离株GD 0 6与鹅源TMUV JS804株、鸭源TMUV(BYD-1株SD株)有极高的核苷酸(99.8%)及氨基酸(100%)同源性,但这三者之间宿主嗜性、致病性差异等关系如何需更加深入的研究。

[1]曹贞贞,张存,黄瑜,等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J].中国兽医杂志,2010,46(12):3-6.

[2]Su J,Li S,Hu X,etal.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu-related Flavivirus[J].PLoS One,2011,6(3):e18106.

[3]Cao Z,Zhang C,Liu Y,etal.Tembusu virus in ducks,China[J].Emerg Infect Dis,2011,17(10):1873-1875.

[4]Yan P,Zhao Y,Zhang X,etal.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in ma-inland China[J].Virology,2011,417(1):1-8.

[5]万春和,施少华,程龙飞,等.一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2010,25(6):663-666.

[6]滕巧泱,颜丕熙,张旭,等.一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J].中国动物传染病学报,2010,6:1-4.

[7]傅光华,黄 瑜,施少华,等.鸡黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建畜牧兽医,2011,33(3):1.

[8]陈仕龙,陈少莺,王劭,等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定[J].福建农业学报,2011,26(2):170-174.

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[10]万春和,施少华,程龙飞,等.鸭出血性卵巢炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J].福建农业学报,2011,26(1):10-12.

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