基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术

于军超，张乐萃，高志强，张鹤晓，马贵平，蒲 静，张利峰，吴亚琼，王慧珊，朱淑芬，张 伟，谷 强

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛266109；2.北京出入境检验检疫局，北京 朝阳100026；3.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安271018）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病，是国际贸易中最重要动物传染病之一［1］。最易感染的动物是黄牛、牦牛、犏牛、水牛、猪、羊、骆驼、鹿。通过交叉保护试验和血清学试验确定FMDV有7个血清型，即O、A、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3，及70个以上的血清亚型［2］。血清型之间无交叉和交叉免疫现象［3］。通过检测特异性抗体应答反应，可对FMDV感染作出诊断。通常采用病毒中和试验（VN）和ELISA方法，也是贸易中指定使用的方法。中和试验具型特异性，但是要求条件高，并且需要2～3d才能提供结果，少数血清在稀释倍数低时会出现假阳性。ELISA试验也具型特异性，而且具备敏感、快速、稳定、可定量等优点［3］。本试验旨在利用原核高效表达系统在大肠杆菌中表达FMDV O型的VP1蛋白，建立检测FMDV O型抗体的间接ELISA方法。

1 材料与方法

1.1 试剂 Trizol，购自Invitrogen公司；DNA片段回收试剂盒，限制性内切酶SacⅠ，HindⅢ，pMD－T20载体克隆试剂盒，T4DNA连接酶，DNA快速纯化回收试剂盒，质粒快速提取纯化试剂盒，购自TaKaRa公司；M－MLV反转录酶，RNA酶抑制剂，TaqDNA聚合酶，购自Promega公司；His·Bind蛋白纯化试剂盒，购自Novagen公司；HRP标记的rec Protein G，购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 病毒核酸、质粒、宿主菌及血清 O型O／YN－1／2005病毒核酸，云南检验检疫局动物检疫实验室提供；原核表达质粒pET－32a，本实验室保存；大肠杆菌（E.coli）Top10，Rosetta，购自北京康为世纪生物科技有限公司；口蹄疫病毒阳性血清，购自兰州兽医研究所。

1.3 口蹄疫病毒O型VP1基因扩增、克隆 根据已知序列于口蹄疫病毒O型基因两侧序列，利用Oligo 6.0设计以下两对引物，用于扩增O型和基因的编码区序列，设计的引物名称、序列见表1。

表1 用于扩增口蹄疫病毒1D编码区的引物名称和序列

42℃反转录30min之后进行PCR扩增。将扩增产物用DNA片段回收试剂盒回收后，按照试剂盒说明将目的片段克隆于pMD－T20载体转化大肠杆菌Top10，涂布于含有氨苄的LB琼脂培养基中，于37℃条件下过夜培养。第2天挑取菌落于LB中37℃过夜培养，对菌液进行PCR鉴定后进行测序。将序列正确的质粒，命名为pMD－T20－O－VP1。

1.4 原核表达载体构建与序列分析 分别用限制性内切酶SacⅠ，HindⅢ对 pMD－T20－O－VP1和pET－32a37℃过夜双酶切，然后用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌Top10，提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。将鉴定为阳性的质粒分别命名为pET－32a－O－VP1。对插入片段进行序列测定。

1.5 重组蛋白的诱导表达 将重组质粒pET－32a－O－VP1转化Rosetta宿主菌后，加入终浓度为1.0 mmol／L的IPTG进行诱导表达，分别在诱导前，诱导后6h取菌液1.0mL，5 000r／min离心10min，收集菌体。将表达产物进行SDS－PAGE电泳。

1.6 重组蛋白的诱导表达的优化 在菌液OD600nm分别为0.6和1.0时用1.0mmol／L的IPTG在37℃进行诱导表达，分析其表达量的变化；之后，在菌液OD600nm＝1.0时，分别用0.5mmol／L，1.0 mmol／L和2.0mmol／L 的IPTG 在37℃诱导表达，分析其表达量的变化；此外，在菌液OD600nm＝1.0时，用1.0mmol／L IPTG 分别于28℃和37℃条件下进行诱导表达，分析其表达量的变化。

1.7 重组蛋白的纯化与复性 在变性条件下采用His·Bind试剂盒对重组蛋白VP1进行亲和层析纯化。在4℃条件下进行稀释复性。复性24h后，装入透析袋中，对50mmol／L Tris－Cl（pH 值9.0）进行透析，将透析后的蛋白溶液用PEG（分子量20 000）浓缩后，12 000r／min（4℃）离心15min，收集上清，过滤除菌后，小份分装，保存于－80℃。

1.8 重组蛋白的反应原性检测

1.8.1 Western－blot分析 将诱导表达菌和对照菌全菌体蛋白经SDS－PAGE电泳分离后，按常规方法进行电转印。转印结束后，用口蹄疫病毒O型阳性血清和HRP标记的rec蛋白G进行Westernblot检测，验证蛋白的反应原性。

1.8.2 ELISA分析 用0.5mol／L的碳酸缓冲包被液将0.25mg／mL的纯化重组蛋白抗原分别作50，100，200，400，800倍5个倍比稀释度，包被酶标反应板，阳性血清和阴性血清作1∶40稀释，酶标抗体采用HRP标记的rec蛋白G，用ELISA方法验证蛋白的反应原性。

1.9 重组间接ELISA方法的建立 按照ELISA方法建立的常规程序，对方法建立过程中的各个条件进行了优化和确定其中酶标抗体采用HRP标记的rec蛋白G。

1.10 间接ELISA方法特异性试验

1.10.1 阻断试验 用血清稀释液将FMDV O型灭活抗原做1∶2稀释，同时用血清稀释液把O型阳性血清和阴性血清分别做各稀释度倍比稀释，观察FMDV O型病毒抗原是否能阻断阳性血清反应。1.10.2 特异性交叉反应试验 以最适浓度抗原包被酶标板，分别对FMDV－A型、O型、C型、Asia 1型阳性血清，收集的猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪细小病毒的阳性血清作1∶40稀释，作ELISA测定，从而验证方法的特异性。

1.11 板内和板间重复性试验 用重组蛋白包被ELISA板，对3份阳性血清和3份阴性血清样品进行检测，重复4孔，进行板内重复性试验；用重组蛋白分别包被4块反应板，分别对2份阳性血清和2份阴性血清进行板间重复性试验，并对检测结果进行数据统计。

1.12 标准阳性血清效价测定 O型标准阳性血清从1∶40作2倍系列稀释，确定方法的检测限。

1.13 对临床样品的检测 用建立的间接ELISA方法检测了2000年以来血清样品355份，其中包括进口血清257份，免疫血清98份。并与液相阻断ELISA试剂盒进行这些临床样品进行检测，比较符合率。

2 结果

2.1 O型口蹄疫病毒VP1编码基因扩增结果 在比对口蹄疫病毒O型1D基因编码区两侧序列基础上设计引物，对 O／YN－1／2005病毒核酸进行 RTPCR扩增，经电泳，观察到了预期大小为657bp的特异性条带（见图1）。

图1 目的片段RT－PCR扩增结果

2.2 O型口蹄疫病毒VP1原核表达载体的构建与序列测定分析 将657bp的PCR产物克隆入pMD－T20载体后，经限制性内切酶SacⅠ，HindⅢ对pMD－T20－O－VP1和pET－32a37℃过夜双酶切后，将VP1克隆入pET－32a，即为构建的表达载体pET－32a－O－VP1。将表达载体质粒进行测序，与预期结果一致。

2.3 O型口蹄疫病毒VP1蛋白的诱导表达 将重组质粒pET－32a－O－VP1转化 Rosetta宿主菌后，将诱导表达前以及诱导后不同时间，分别取菌液1.0 mL，5 000r／min离心10min，收集菌体，加入2×SDS上样缓冲液，煮沸5min，用12%SDS－PAGE胶检查，结果见图2，在诱导后6h，可观察到明显的重组蛋白表达，分子量约为43ku，与预期大小一致。

2.4 重组蛋白的表达条件优化 经试验确定的最佳表达条件为在菌液OD600nm＝1.0时，用0.5 mmol／LIPTG在28℃诱导8h，可产生部分可溶性表达，但大部分菌体蛋白为包涵体表达。

2.5 重组蛋白的纯化与复性 经纯化透析后得到高纯度的重组蛋白，见图3。

2.6 重组蛋白的反应原性检测

2.6.1 Western－blot检测结果 进行 Westernblot检测，可以检测到约43ku大小的预期条带，结果见图4。表明重组蛋白具有良好的反应原性。

2.6.2 ELISA试验结果 ELISA试验结果显示，不同量的表达蛋白包被酶标反应板之后，用1∶40阴阳性血清检测，P／N值可达5.24～7.71之间，进一步表明重组蛋白具有良好的反应原性，可作为重组抗原建立ELISA方法。

2.7 重组ELISA方法的建立

慢跑能增加大学生的积极幸福感，对心理烦恼和疲劳感无影响；慢跑结合音乐可以增加大学生的积极幸福感，能有效地降低大学生的心理烦恼感，对疲劳感无响应。两种类型的慢跑，即慢跑组和慢跑结合音乐组的对比：在积极幸福感上，运动后慢跑组和慢跑结合音乐组无差异；在心理烦恼感上，慢跑结合音乐比慢跑更有效地降低大学生心理烦恼感；在疲劳感上，慢跑比慢跑结合音乐更能降低大学生的疲劳感。

2.7.1 重组蛋白抗原最适包被浓度和待检血清稀释浓度的确定 随着抗原浓度的减小和血清稀释倍数的增加，血清的OD450不断减小，当重组抗原包被浓度为0.062 5μg时，血清稀释度为1∶40时，P／N值较高，而且阴性血清OD450值相对较低。据此，我们确定抗原包被量为0.062 5μg，血清稀释度为1∶40。

2.7.2 重组蛋白抗原包被和封闭条件的确定 用重组蛋白在最适包被浓度包被酶标板，37℃中2h，然后于4℃条件下过夜，所测得的P／N值较2、3组高，因此选为最适包被条件。

2.7.3 封闭液的确定 3种适用于此酶标抗体的封闭液，比较封闭效果。含1%明胶的PBST封闭液的封闭效果好，从而确定为合适的封闭液。

2.7.4 酶标抗体反应时间确定 为适用于多种动物的抗体检测，我们选择HRP标记的rec G作为酶标抗体，经优化，确定 HRP标记的rec G（1∶2 000稀释）的反应时间为37℃30min。

2.7.5 间接ELISA方法阴阳临界值的确定 根据统计学原理，样本的OD450值＞阴性血清OD平均值X＋3×SD，可以在99.9%的置信水平上判定为阳性。计算30份血清的OD450值平均值＝0.191，标准差SD＝0.039，因此，ELISA阴阳性临界值等于0.191＋3×0.039＝0.308。为便于判定结果，确定样本临界值为0.3。

2.8 特异性试验

2.8.2 特异性交叉反应试验 结果表明，仅O型阳性血清与包被抗原产生免疫反应，结果为阳性，其他血清型的FMDV阳性血清和阴性对照血清的OD450nm值均小于0.3，为阴性。表明，重组蛋白与口蹄疫病毒O型阳性血清，有较好的特异性，可以用于口蹄疫病毒O型抗体的检测。

2.9 重复性试验 对于不同的血清样品，板内重复试验变异系数最大为4.7%，小于5%。对4份已知的阴阳性血清用4块板子进行板间重复试验的变异系数最大为9.49%，小于10%，可以满足检测需求，表明建立的方法重复性良好。

2.10 标准阳性血清检测极限测定 O型标准阳性血清从1∶40作2倍系列稀释，确定方法的检测灵敏度。结果显示，血清效价为1∶320。

2.11 对临床样品的检测 用建立的间接ELISA方法检测了2000年以来血清样品355份。与口蹄疫病毒O型液相阻断ELISA试剂盒进行比较，比较符合率，结果见表2。

表2 对临床样品检测结果的比较

经过计算，本试验建立的间接ELISA方法与液相阻断ELISA比较，特异性为98.46%，敏感性为100%，两者的符合率为98.87%。经统计学方法分析，两种方法的差异不显著（P＞0.05）。

3 结论与讨论

在本试验中，我们应用生物信息学对口蹄疫病毒O型VP1的抗原指数进行分析，并进行重组表达，用来作为检测抗原，用以检测口蹄疫病毒O型抗体。

尽管克隆的VP1基因经序列测定无突变，但仍含有一些稀有密码子［4］，但我们采取可给予表达过程提供稀有密码子的Rosetta受体菌，外源基因以包涵体的形式获得高效表达。但也有一部分以可溶性存在。我们将包涵体溶解后，在变性条件下采用His·Bind蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。获得高纯度蛋白。通过Western－blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的抗原性。而且与其他的阳性血清无交叉反应。

ELISA方法具有特异、敏感、重复性好以及易于操作等优点，已经广泛用于多种动物传染病的检测。本试验利用原核表达的重组蛋白建立了检测口蹄疫病毒O型抗体的间接ELISA方法，并与商品化试剂盒进行了比较。通过对355份血清的检测结果表明，二者在特异性为98.46%，敏感性为100%，符合率为98.87%，进一步收集更多数量的血清对我们的方法进行验证和完善，将是我们今后的重要任务。

［1］Office International des Epizooties.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals［M］.Office International des Epizooties，Paris，France.www.oie.int.2012.

［2］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学技术出版社，1997.

［3］Lu Z，Cao Y，Bao H，etal.Techniques developed in China for foot－and－mouth disease［J］.TransboundEmerg Dis，2008，55（5／6）：196－199.

［4］Sanyal A.Monhapatra J K，Kumar R M，etal.Complete nucleotide sequence analysis of a vaccine strain and a field isolate of foot－and－mouth disease virus serotype Asia I with an insertion in VP1genomic region［J］.Acta Viol，2004，48（3）：159－166.