小鼠硫酸黏杆菌素中毒神经电生理时效变化

代重山，李继昌，马 晶，高瑞霞

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.东北农业大学医院，黑龙江 哈尔滨150030；3.东北农业大学生命学院，黑龙江 哈尔滨150030）

近10年来，由于世界范围内多重耐药（MDR）革兰阴性菌株的出现，特别是鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌的MDR的蔓延，已成为临床治疗的棘手问题，甚至引起暴发性播散感染，导致较高的死亡率，以及新抗生素的短缺，使得已被弃用20余年的黏杆菌素重新得以评估和使用［1］。Lim等［2］认为，在未来5年，黏杆菌素将是临床治疗MDR革兰阴性细菌感染的最佳选择，也是最后的防线。

目前，黏杆菌素诱发的肾毒性与神经毒性严重阻碍着临床应用，已经引起临床学者及科学家的广泛关注，但其神经毒性机制由中枢神经系统介导还是周围神经系统介导目前还不清楚［3］。动物试验及临床研究发现，黏杆菌素可以引起动物或人四肢麻木、四肢无力、下肢疼痛、感觉异常、多发性周围神经炎，这表明，黏杆菌素可能直接或间接的对周围神经造成损伤［1，4－5］。因此，本文通过静脉注射硫酸黏杆菌素，使用神经电生理手段评价其周围神经毒性，分析黏杆菌素对小鼠坐骨神经电生理指标随时间的动态变化，筛选敏感指标，为黏杆菌素神经毒性的机制研究及临床神经毒性的早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器 BL－420E生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司生产；硫酸黏杆菌素原粉（20195 U／mg），美国Sigma公司产品；戊巴比妥钠，德国生产。

1.2 动物处理 健康雄性昆明系雌性小鼠50只，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，适应性饲养1周，正式试验时小鼠体重在18～22g，分为硫酸黏杆菌素处理组和对照组。试验组小鼠尾静脉注射黏杆菌素7.5mg／kg（10mL／kg体重），每天2次，间隔12 h，连续给药7d，对照组注射生理盐水。以给药当天为0计，在硫酸黏杆菌素处理组在初次给药后1，3，7 d，和15d，4个时间点，对其进行相关指标测定，每个时间点10只。常规颗粒饲料饲养，自由饮水，温度控制在（22℃±2℃），湿度（50±10）%。

1.3 步态评分 按照文献［6］方法，将小鼠放在空旷的地面上，使其自主行动，观察3min，进行步态评分。1分：正常步态；2分：轻微异常的步态（轻微的共济失调，足张开，行动吃力）；3分：中度异常的步态（明显的共济失调，足张开，移动时肢外展）；4分：重度异常的步态（足张开，不能支持体重，无法站立）。

1.4 坐骨－胫神经电生理指标测定 试验过程中，控制室温在25℃±2℃，0.4%戊巴比妥钠40mg／kg体重腹腔注射麻醉小鼠，使用加热灯控制小鼠体温。暴露小鼠左后肢坐骨神经干，覆盖温热石蜡油，并连接钩状刺激电极，记录针电极连接脚踝及小鼠第1趾间肌肉，接地电极连接刺激电极与记录电极之间的皮肤上。将动物后足以自然肢体状态与脊柱成45°夹角向斜后方拉直，沿坐骨神经经过部位和方向，在动物体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离（s），潜伏期为刺激伪迹起始部至动作电位起始部之间的时间（t）根据v＝s／t，计算 NCV。刚开始出现动作电位波形时的刺激强度为阈刺激强度（TP）、动作电位波形达到最大时所对应的刺激电位为最大刺激强度（MI）、动作电位起始至结束间时间为复合动作电位时程（CAPD）、刺激伪迹起始部与动作电位起始部之间的距离为复合动作电位潜伏期（CAPL）、波峰波谷的高度差为复合动作电位波幅（CAPA）。所有指标在30min内完成。

1.5 数据统计 数据通过Mean±SD表示，对小鼠体重变化进行t检验；电生理参数、步态评分使用SPSS11.5One－Way ANOVA 统计分析；P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 一般毒性观察 小鼠每次给药后表现出兴奋不安，随后逐渐呆滞不动，此后腹式呼吸明显，约10min后呼吸基本恢复正常。在第4天第1次给药后，1只小鼠出现严重的抽搐，伏地不起，后缓慢恢复。从小鼠初次给药后第4天起，试验组大部分小鼠表现出精神抑郁，活动减少，后肢无力，直至初次给药后第10天后，部分小鼠精神状态逐渐开始恢复，至15d时仍然有少数小鼠表现为精神抑郁，后肢无力。

2.2 体重变化 结果见图1，对照组小鼠在15d内持续稳定的增长，硫酸黏杆菌素组小鼠增长速度小于对照组，在给药后1d后体重出现负增长。在给药后3、7d和15d体重较对照组下降9.28%（P＜0.05）、12.5%（P＜0.01）和11.3%（P＜0.01）。

2.3 步态评分变化 小鼠在初次给药后1d、3d步态评分分别为1.20±0.42，1.23±0.44，较对照组（1±0）无显著差异。至给药7d和15d后步态评分分别为1.80±0.63（P＜0.05）和1.40±0.52（P＞0.05），较对照组差异不显著。试验中，所有步态异常的小鼠，1只在第7天出现明显的共济失调，步态评分为3分，其余均为2分。

2.4 坐骨神经－胫神经复合神经电生理指标的变化

2.4.1 TP与 MI 初次给药1、3、7、15d后，与对照组相比，硫酸黏杆菌素处理后，小鼠TP逐渐增加趋势，分别增加为59.8%，60.5%，192.5%（P＜0.01），70.1%。MI分 别增加 3.63%，12.7%，100%（P＜0.05），29.1%（图2）。

2.4.2 CAPA、CAPL、CAPD及 NCV 初次给药1、3、7、15d后，与对照组相比，硫酸黏杆菌素处理后，CAPA下降，分别为0.92%、16.2%、47.6%（P＜0.01）、38.8%（P＜0.05）（图3）；潜伏期增加，分别为9.0%，9.0%，14.6%（P＜0.05），11.2%；CAPD增加，分别为15.1%，11.5%，52.8%（P＜0.05），20.6%；NCV减低，分别为7.6%，7.5%，12.7%（P＜0.05），9.3%（图2）。

2.4.3 波形 对照组波形正常，给药后第1天有2只小鼠出现重复性动作电位，第3、7天波形与对照组有所不同，出现三相动作电位，但未见重复行动作电位（图3）。

图3 静脉注射硫酸黏杆菌素后小鼠坐骨－胫神经复合神经电记录

3 讨论

本试验中，小鼠给药量为7.5mg／kg体重·12h相当于临床0.75mg／kg体重·12h。小鼠初次给药后表现出一定的急性毒性症状［5］，腹式呼吸明显，但10min内得以恢复，这可能与黏杆菌素影响机体的神经递质相关［2，9］。小鼠步态评分趋势、呼吸症状随着给药次数的增加而逐渐加重，可能与黏杆菌素在小鼠体内的剂量累积及时间依赖性相关［1］。硫酸黏杆菌素给药3d、7d后，小鼠体重显著下降，与黏杆菌素致使小鼠食欲下降，致使其体重下降相关［5］。或与黏杆菌素的肝毒性、肾毒性相关，致使肾脏对黏杆菌素的排除障碍导致黏杆菌素在体内累积造成［4，7］。

Bosso等［8］研究发现，临床患者静脉注射黏杆菌素后，29%的病人发生感觉异常、共济失调。临床研究表明，周围神经系统不像中枢神经系统那样有着血脑屏障的保护而更易产生毒性反应，神经电生理检测对黏杆菌素神经毒性的监控具有重要意义［10］。在本试验中，神经电生理指标随时间变化而发生时效性变化（图2）。在连续静脉注射硫酸黏杆菌素给药7d后，CAPA、TP及MI显著降低，可能与被触发轴突的数量或神经纤维的密度相关［6］，NCV的显著降低，可能与黏杆菌素抑制突触前乙酰胆碱等神经递质的释放相关［9］。

黏杆菌素具脂质A基团模式结构，并携带游离阳离子氨基酸，可与高脂质含量神经元相互作用，产生神经毒性［1］。而神经髓鞘的膜性结构含有大量的不饱和脂肪酸，易受脂质过氧化损伤，使髓鞘不完整或缺失、轴突直径发生变化，从而导致膜电容和阻抗改变，致使触发轴突的数量的减少，或者通过脂质过氧化损伤而对神经轴突造成损伤，从而引起一系列的神经电指标发生变化。黏杆菌素可引起物质能量代谢障碍以及机体抗氧化能力的改变［11］，使细胞膜的特性发生改变；亦可能引起脊髓背根神经节细胞、腓神经轴突中钾钠钙氯离子的浓度改变［12］，从而对电生理指标产生影响。

在第15天小鼠毒性行为症状有所缓和，但CAPA仍差异显著，与 Wahby等［10］报道相似，即在病人因发生神经毒性而停止用药的第5天后，CAPA显著降低，说明黏杆菌素诱发的神经毒性具有一定的可恢复性［1，4，9］。此外，在小鼠给药1d后，部分小鼠出现重复性动作电位（图3－B），可能与临床多发性神经炎相关，但在随后的神经电生理未见此类现象，有待进一步的证实。

本试验表明，硫酸黏杆菌素可诱导小鼠坐骨－胫神经电生理发生时效性变化，暗示黏杆菌素可造成周围神经毒性的发生，但其作用机制还有待进一步的研究。此外，CAPA指标较为敏感，有助于临床诊断。

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