兔发生伪狂犬病的报告

刘文强，秦绪岭，苏建青，江 成，王守山，路建彪

（聊城大学农学院，山东 聊城252059）

伪狂犬病病毒（peudorabies virus，PRV）是引起牛、羊、猪、兔、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。PRV在猪群中的发生较为普遍，兔通常作为人工感染的试验动物，但是PRV在兔场自然感染发病并造成种兔繁殖障碍的病例则未见报道。2011年山东省西部4家獭兔场在1月内连续发生以怀孕母兔流产、木乃伊胎、死胎为主的疫病。个别母兔和仔兔出现神经症状后死亡。对其进行了流行病学调查和血清学鉴定。从胎儿脑及内脏组织中分离到多株病毒，对其中1株进行了初步鉴定。结果表明，所分离病毒为伪狂犬病病毒。

1 材料与方法

1.1 发病情况 4家獭兔养殖场，1月内母兔流产率超过26%（33／126）。流产以木乃伊胎和死胎为主，极个别产下弱仔，48h内死亡。33只流产母兔有4只出现神经症状，表现为尖叫、转圈、麻痹、运动不协调、口吐白沫，大多数母兔无明显症状，病死兔剖检无明显病变，少数家兔的病变包括肾脏少量针尖大出血点，脑膜明显充血，脑脊髓液增多，肝、脾少量大小不等的灰白色坏死点，有的病例可见肺充血、水肿。

1.2 诊断 对发病种兔无菌采集血液并分离血清，分别使用伪狂犬病乳胶凝集抗原、标准阳性血清及阴性血清（科前公司）、沙门菌平板凝集抗原（中国兽医药品监察所）、布鲁菌虎红平板凝集抗原（中国兽医药品监察所）检测发病后抗体情况；使用gEELISA（科前公司）检测采集的血清样品。采集发病兔脑组织、肝脏和肾脏等制备病料悬液，检测兔瘟病毒、巴氏杆菌和沙门菌。对病料进行细菌学检查：取病兔肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结组织触片，革兰染色镜检；同时将以上病料接种于胰酶大豆肉汤和厌氧肝汤，置于37℃培养5d。

1.3 材料

1.3.1 试验动物 SPF鸡胚、家兔及小鼠，分别购自山东大学医学院实验动物房和聊城大学动物生态生理学实验室等，经伪狂犬病乳胶凝集试验检验均为阴性。9～11日龄SPF鸡胚制备CEF细胞。

1.3.2 参考病毒株和细胞 伪狂犬病病毒La株，为山东农业大学动物传染病学实验室保存。BHK－21细胞和Vero细胞，购自武汉大学典型培养物保藏中心。

1.4 病毒分离 参考文献介绍的方法处理病料，分别接种到单层PK15细胞和CEF细胞，每瓶接种2 mL，每个样品接种2瓶，PRV La株作阳性对照。产生细胞病变（CPE）者，继续传代直至其CPE出现时间稳定为止。将CPE典型且出现时间稳定的培养物分别接种于BHK－21细胞、Vero细胞，比较其所致 CPE情况［1－2，9］。

1.5 毒株 TCID50滴定 参考文献［1，2，9］介绍的方法，取克隆毒株在BHK－21细胞上测定TCID50。

1.6 克隆毒株理化性质鉴定 参考文献测定病毒对乙醚、氯仿、热的耐受性，并进行阳离子保护试验。

1.7 动物接种试验 取6只家兔，其中4只腹侧皮下注射病毒细胞培养液1mL／只（107TCID50），另设2只家兔注射Hank′s液作对照，观察家兔发病情况。另取12只小鼠，其中10只腹侧皮下注射病毒细胞培养液0.2mL／只，另2只小鼠注射Hank′s液作对照。

1.8 中和试验 采用固定血清稀释病毒法，测定阳性组和对照组的TCID50，计算中和指数。

1.9 病毒特异性的PCR检测 根据已发表的PRV La株的gE基因的核苷酸序列，根据已发表的PRV La株gE基因序列自行设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见文献［7－9］。使用该对引物对分离病毒进行PCR鉴定。使用pMD18－T将其克隆后进行序列测定，使用DNAStar软件进行序列分析和同源性比较。

2 结果

2.1 血清学检测 发病家兔的血清与PRV呈现强阳性反应，O型血凝集试验检测兔瘟病毒阴性，沙门菌和布鲁菌病抗体检测均为阴性。细菌学检查也均为阴性。由表1可知，感染PRV的4家兔场中，不同的检测方法的结果略有差异，但总体上，流产母兔的阳性率为71.4%～80.0%，妊娠母兔为45.1%～62.2%，种公兔为27.8%～55.6%，流产仔兔81.3%。

表1 各种家兔感染PRV的检测情况

2.2 病毒致CPE结果 接种细胞CPE的出现：将病料上清接种于CEF细胞，均可在第1代观察到CPE，并且与PRV La株所致病变一致。在Vero细胞和BHK－21细胞上，均产生典型的细胞病变。在Vero细胞上出现明显的细胞融合和“拉网”现象，出现50%CPE病灶至全部细胞脱落的时间很短，而在CEF则不出现“拉网”现象。该病毒在BHK－21细胞上的细胞病变为细胞圆缩，折光性增强，病变细胞与正常细胞界限清楚，病变细胞各自独立，不发生融合。与PRV La株的表现一致［9］。

2.3 病毒TCID50测定 克隆纯化病毒在BHK－21细胞上的滴度，按Reed－Muench法计算的TCID50＝10－6.18／0.1mL。

2.4 病毒的理化性质 与对照相比，当TCID50降低2个滴度时，可判为对理化因素敏感。结果表明，所分离的病毒对乙醚、氯仿、热以及阳离子敏感。

2.5 中和试验 分离毒在细胞上的中和指数为67，大于50，即PRV阳性血清能够中和分离毒。

2.6 动物试验 分离的病毒接种于家兔和小鼠，均产生了典型的伪狂犬病症状。4只家兔表现奇痒，最后相继麻痹死亡，对照家兔未见异常；小鼠于接种60h后表现被毛杂乱，狂躁不安，啃咬腿跟内侧及注射部位，至96h时死亡8只，另2只麻痹不动，对照动物无异常变化。剖检见肺严重出血，脑膜轻微充血，肝有少量出血和坏死，其他组织器官无明显病变。

2.7 PCR扩增 3个兔体分离毒株和PRV La株（作为阳性对照）均在约1 740bp的同一位置出现1条特异性条带，而正常BHK－21细胞和乳胶凝集试验检测阴性的家兔脾脏（作为阴性对照）则不能扩增出任何条带（图1）。该片段送至TaKaRa公司测序，与结果表明与PRVLa株gE基因序列（Gen－Bank登记号：504333）同源性为98.5%。

3 讨论

本试验从山东4家兔场的流产母兔中分离到数株病毒，就其中1株进行了详细鉴定。从血清学、病毒学及核苷酸水平上证实了所分离的病毒为PRV。

图1 PRV gE基因PCR扩增结果

家兔流产在家兔饲养过程中并不多见。排除了兔瘟、沙门菌及布鲁菌病感染情况后，饲料企业将样品送到有关部门检验也排除了饲料中毒和真菌毒素污染的可能。通过血清学、病毒学及分子生物学诊断，本试验证实了PRV自然感染引起家兔繁殖障碍的病例。我国自1947年在猫发现首例伪狂犬病以来，陆续有猪、牛、羊、貂、狐、鹿、驴、骡等感染该病的报道。兔作为PRV研究的易感动物，鲜有自然感染而且造成规模养殖场种兔流产的疫情报道。猪是PRV的原发感染宿主，可长期带毒和排毒［6，8］。PRV兔体自然分离株的特性及部分致病基因片段与在本区域广泛流行的PRV La株具有完全相同的特征和同源性。考虑到PRV的生物学特性，在该区域猪、獭兔养殖密度大的情况下，该毒株似乎是猪体内的野毒自然感染家兔的结果，造成家兔产生上述严重症状并在兔群中流行，在家兔分娩季节造成严重的繁殖障碍。以上PRV的流行新特征值得注意。该病发病急、死亡快，造成流产后损失较大，而且临床检查常常见不到明显的症状和病变，给临床诊断造成很大困难，必须依靠详细的流行病学调查和实验室诊断。

目前我国已是伪狂犬病流行广泛的国家之一，至今尚未彻底清除该病。许多国家通过接种基因缺失苗配合gE－ELISA 成功清除了伪狂犬病［3－5］，许多学者也呼吁在我国采取相应措施清除该病。本文提示，必须充分重视兔伪狂犬病的发生，密切关注其流行情况，及时扑灭及消除PRV感染，否则不能排除兔PRV重新传染给猪群，会严重影响该病在养猪场的净化和根除。

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