猪链球菌河北分离株对常用抗菌药物的耐药性

芮 萍，陈翠珍，段玲欣，王秋悦，杨彩然，马增军

（河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛066600）

猪链球菌是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原，由该菌引起的猪链球菌病在所有养猪业发达的国家均有报道，并引起广泛流行，且人通过特定的传播途径亦可感染该菌。如何防止该病的发生和传播，是当前猪病防控的一项重要课题。化学药物的治疗是控制该病的有效手段，但随着抗菌药物的广泛使用，临床中病原菌的耐药现象也日趋严重，据国内外文献报道，猪源链球菌尤其对大环内酯类、四环素类及磺胺类抗菌药物耐药性最为严重［1－4］。为了解细菌耐药情况并制定合理的治疗方案，本试验选择8类28种兽医临床常用药物，对临床分离的猪链球菌做体外抗菌活性测定，为临床合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 34株供试菌株均为2001～2010年分离自河北省各地区的病死猪肺脏、脾脏、肾脏、心血、脑以及关节液等，经PCR鉴定为猪链球菌，其中22株SS2，1株SS7，2株SS9，9株未定型。金黄色葡萄球菌ATCC29213为标准质控菌株，购自中国药品生物制品检定所。所有菌株置于30%甘油肉汤中，－20℃保存。

1.2 培养基 MHB、MHA培养基均为北京陆桥技术有限责任公司产品，用于药敏试验，临用前均添加5%犊牛血清（杭州四季青公司），并用参考菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213进行质控，不符合要求者则淘汰。

1.3 抗菌药物 β－内酰胺类抗生素：青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢噻呋。磺胺类药物：磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、三甲氧苄氨嘧啶。大环内酯类抗生素：红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、替米考星、泰乐菌素。喹诺酮类抗菌药：环丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星。林可胺类抗生素：林可霉素、克林霉素。四环素类抗生素：四环素、强力霉素。酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考。氨基糖苷类抗生素：链霉素、阿米卡星，庆大霉素。以上药品配制成一定浓度后于－20℃保存，临用前稀释为使用浓度。

1.4 体外最小抑菌浓度测定 严格按照美国临床实验室标准化协会（CLSI，2008）推荐的标准微量稀释法进行试验操作和结果判断［5－6］，每菌增菌至108CFU／mL，然后稀释为105～106CFU／mL，接种于含不同药物浓度的96孔板中，37℃培养24h，观察结果。检测结果判定按NCCLS标准执行，只有当阳性对照孔（不含抗生素）孔内细菌有明显生长，加样孔透明或孔底的沉淀不大于2mm稀释度孔，才是该药的MIC。对所测得的MIC结果经统计学处理，得出MIC50、MIC90及 MIC范围，并计算细菌对各抗菌药的耐药率（包括中介菌株）、抑菌率。

2 结果与分析

2.1 β－内酰胺类抗生素体外抑菌活性 见表1。

表1显示：β－内酰胺类抗生素对受试菌株敏感率较高，头孢噻呋对临床分离的34株猪链球菌的作用最好，抑菌率达85.3%（29／34），其次阿莫西林、氨苄西林、头孢噻吩和头孢唑啉钠抑菌效果也较好，抑菌率分别达76.5% （26／34）、76.5% （26／34）、82.3% （28／34）、82.3% （28／34），MIC50均≤2g／mL，青霉素G对测试菌株的抑菌效果相对较差，抑菌率为64.7%（22／34）。另外，所选各药均对早期分离的猪链球菌有较强的抑菌效果。

表1 β－内酰胺类抗生素对临床分离猪链球菌的体外抑菌活性

2.2 大环内酯类抗生素体外抑菌活性 见表2。临床分离的猪链球菌对所选5种大环内酯类抗生素中，除替米考星耐药率为50% （17／34）外，测试菌株对红霉素、泰乐菌素、罗红霉素、阿奇霉素均产生较强的耐药性，耐药率分别为88.2%（30／34）、88.2%（30／34）、76.5%（26／34）、73.5%（25／34），其 MIC50范围为16～64μg／mL，MIC90均为256μg／mL，且高度集中在高耐药区。

表2 大环内酯类抗生素对临床分离猪链球菌的体外抑菌活性

2.3 喹诺酮类抗菌药体外抑菌活性 见表3。在所选的喹诺酮类抗菌药中，环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星对所分离的猪链球菌表现为较好的抗菌活性，其抑菌率分别为61.8%（21／34）、58.8%（20／34）、58.8%（20／34），而诺氟沙星和培氟沙星的效果较差，抑菌率分别为29.4%（10／34）和26.5%（9／34）。

表3 喹诺酮类抗菌药对临床分离猪链球菌的体外抑菌活性

2.4 磺胺类药物体外抑菌活性 见表4。临床常用的磺胺类药物对所有猪链球菌抗菌作用极差，菌株对其表现出高度耐药性，所测试的磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑和甲氧苄啶对34株分离菌株的敏感率均低于20%，其 MIC50，MIC90均为1 024μg／mL，且高度集中在高耐药区，相差不超过一个稀释倍数。

表4 磺胺类药物对临床分离猪链球菌的体外抑菌活性

2.5 其他类抗生素体外抑菌活性 见表5。表5结果显示，四环素类抗生素、林可胺类抗生素、氨基糖甙类抗生素对临床所分离的猪链球菌抗菌作用极差，四环素、强力霉素、林可霉素和克林霉素对所测的34株猪链球菌的抑菌率分别为2.9%、11.8%、14.7%、20.6%。氟苯尼考、氯霉素对所有测试菌株表现为较好的抗菌活性，其抑菌率分别为67.6%、58.8%。

2.6 34株猪链球菌对8类抗菌药物耐药谱分析 药物敏感试验结果显示（表6），34株检测菌株全部为耐药菌，并以多重耐药为主。在所测得的34株细菌中，91.18%的菌株对3种以上药物耐药，其中以4耐、5耐最多，占 23.53%、20.59%；9 耐也居多，占17.65%，6耐、7耐和8耐均占8.82%。各多重耐药菌耐药谱也不尽相同，34株细菌对9种药物可形成14种耐药谱型，其中以9药耐药谱型红霉素－克林霉素－四环素－磺胺甲基异恶唑－阿米卡星－头孢唑啉－青霉素－环丙沙星－氯霉素为最多，占所有耐药谱型的17.65%，其次为5药耐药谱型红霉素－克林霉素－四环素－磺胺甲基异恶唑－阿米卡星，约占14.7%。

表5 其他类抗生素对临床分离猪链球菌的体外抑菌活性

3 讨论

研究结果显示，临床中分离的菌株多以耐药菌为主，而且大都呈多重耐药，尤其对磺胺类药物、四环素类、大环内酯类、林可胺类、氨基苷类药物耐药性最为严重，耐药非常普遍，且多为高度耐药；对喹诺酮类药物、酰胺醇类的耐药性次之；对青霉素类、头孢菌素类仍保存良好的敏感性，但链球菌对青霉素的中介（低度耐药）率较高，有发展成高度耐药株的趋势，这些数据表明，本次分离的猪链球菌的耐药性与国外的报道有明显的不同，对大环内酯类、β－内酰胺类、林可胺类抗生素的耐药性显著高于瑞典、丹麦、日本等国家分离的链球菌［2－3］，这与我国在猪病预防治疗上使用以上抗生素，并在饲料中添加四环素类、大环内酯类等抗生素有着密切的联系。所以临床用药上分析，青霉素作为高效、低毒的杀菌药物，仍对链球菌保持良好的效果，依然是临床用药的主要治疗药物。其次选择头孢菌素类、喹诺酮类药物等药物作为辅助治疗。

对耐药菌株进一步分析34株检测菌株以多重耐药为主。在所测得的34株细菌中，91.18%的菌株对3种以上药物耐药，其中以4耐、5耐和9耐也居多，多重耐药大多为红霉素、克林霉素、四环素和磺胺类，4种药物同时耐药的菌株为23株，占4耐以上菌株总数的67.6%，由此可见，对4种常用药物的多重耐药情况己相当严重。分析临床猪链球菌菌株耐药性产生的原因，除抗菌药物长期应用导致的“选择性压力”筛选和抗菌药物的不合理使用外，耐药基因在菌株中的广泛传播至关重要。

［1］王丽平，陆承平，唐家琪.32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性［J］.微生物学报，2004，44（6）：794－799.

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