对氧磷酶基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关联

王燕飞 夏海琴

高血压对大、小血管的危害可能有普遍作用［1］。研究发现高血压与体内某些酶的基因多态性有关［2］。已有研究表明PON155 M等位基因是高血压的危险因素，而高血压是动脉粥样硬化性脑梗死的独立危险因素。高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein，HDL）有对抗动脉粥样硬化（artherosc lerosis，AS）的性质，人类血浆对氧磷酶（paraoxonase，PON）与HDL相连接，能阻止低密度脂蛋白胆固醇脂质过氧化物的形成。研究表明PON相关基因（PON1、PON2）与动脉粥样硬化性脑梗死的发生相关［3］。其中PON1基因目前常见的两种基因多态性，PON-1基因多态性与酶活性密切相关，在一定程度上决定了其抗氧化能力，与动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病的发病密切相关。在对氧磷酶1基因编码区还存在两种常见的基因多态性，分别是CGA／CAA置换导致 192位 Arg／Gln多态性（Q192R）和 ATG／TTG 颠换导致 55 位 Met／Len多态性（L55M）。我们应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术研究PON1基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死合并高血压的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择山西汉族脑梗死患者和健康人为研究对象。

1.1.1 实验组 2009年3月份至2010年3月到我院神经内科住院的105例脑梗死患者，并经头部CT和／或MRI证实。纳入标准：①发病到入院72 h内的患者；②符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准［4］；③初次发病患者。排除标准：①有严重心、肝、肺、肾功能不全患者；②有心房纤颤患者；③近期有外科手术或外伤史；④血液病、自身免疫性疾病、妊娠；⑤半年内曾有降脂治疗者；入院72 h内行颈动脉彩超检查，筛查有颈动脉斑块形成。

1.1.2 正常对照组 同期在我院健康体检者 100例，均经过临床检查和／或影像学检查排除脑血管病，无脑血管病家族史。记录以上研究对象的年龄、性别等指标，测量身高、体重、腰围、臀围、血压、血脂、空腹血糖、糖化血红蛋白等临床生物化学指标，计算体质指数和腰臀比。入选者均签署知情同意书。

1.2 方法 血脂水平的测定：受试者空腹12 h以上，平卧30 min后取肘静脉血。血脂测定：总胆同醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL⁃C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL⁃C）均采用全自动生化分析仪测定。DNA提取：空腹静脉血以EDTA抗凝.采用NaI提取法从白细胞中提取基因组DNA。（3）PON1编码区L55M基因型分析：PCR扩增相应的目的片段，长度为144 bp，引物1：GAGTGAT GTATAGCCCCAGTTTC nt，引物 2：AG TCCATTAG GCAGTATCTCCgnt，PCR缓冲液含300 mmol／L Tris⁃HCl，75 mmol／L硫酸铵，5 mmol／L MgCl2，pH10.0。PCR循环：94℃预变性5 min，94℃ 变性1 min，65℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；循环 40次，72℃延伸5 min。扩增产物用HinfⅠ酶切，3%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型（图1）。PON1编码区Q192R基因型分析：PCR扩增相应的目的片段，长度为111 bp，引物 1：TTGAATGATATTGTTGCTGTGGGA CCTGAGnt.，引物 2：CGACCACGCTAAAC CCAAAT ACATCTCCCAGaA nt，PCR 缓冲液含 300 mmol／L Tris⁃HCl，75 mmol／L硫酸铵，5 mmol／L MgCl2，pH 10.0。PCR循环：94℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；循环 40次，72℃延伸5 min。扩增产物用HinfⅠ酶切，3%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型（图2）。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0进行统计学分析，所有计量数据均以（）表示，两组间比较采用t检验。多组间比较采用方差分析，两组间基因型及等位基因计数资料用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般特征 两组年龄、性别、吸烟、体重无显著性差异；收缩压、舒张压、总胆固醇、总甘油三酯及LDL与对照组比较，差异有意义（P＜0.05）。

2.2 PON基因型及等位基因频率的分布 从表1可以看出，PON1192的基因型、等位基因频率分布在对照组和脑梗死组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；而PON1 L55M的基因型分布两组间差异有统计学意义，脑梗死的M等位基因频率明显高于对照组（P＜0.05）。

图2 PON1 Q192R位点酶切电泳图

图1 PON1 L55M位点酶切电泳图

2.3 脑梗死合并高血压患者的PON基因型及等位基因频率分布 表2结果表明PON1 Q192 R基因型及等位基因频率分布三组间差异无统计学意义（P＞0.05），而 PON1 L55 M基因型及等位基因频率分布在脑梗死合并高血压组与对照组和脑梗死无高血压组相比差异均有统计学意义（χ2值分别为8.271和4.114，P＜0.05），脑梗死合并高血压组的M等位基因分布频率显著升高。

3 讨论

脑梗死是在供应脑的血管壁病变或血流障碍基础上发生的急性脑损害，基本病因包括高血压性脑小动脉硬化、脑动脉粥样硬化、血管的先天发育异常，尚有遗传性疾病、炎症、中毒、代谢等导致的脑血管壁病变［5］。随着人们对心脑血管疾病研究的不断深入，越来越多的危险因素逐渐被人们所认识，脑梗死是遗传和环境因素共同作用的疾病，国内外研究发现多种基因多态性与之有关，其中位于人类染色体7q21.3⁃q22.1的基因簇（PONs）是近年来的研究热点。 其基因产物（PON⁃1，PON⁃2，PON⁃3）可能通过影响高密度脂蛋白（HDL）抗LDL氧化能力，抑制氧化的低密度脂蛋白LDL（OX⁃LDL）形成而减少LDL的氧化，破坏OX⁃LDL中溶血磷脂而降低OX⁃LDL水平，从而减轻及延缓AS进程［6］。动脉粥样硬化是合并颈动脉粥样硬化斑块脑梗死发病的病理基础。

表1 脑梗死组与对照组PON基因型及等位基因频率的分布

表2 动脉粥样硬化性脑梗死合并高血压患者的PON基因型及等位基因频率的分布

PON⁃1基因多态性与酶活性密切相关，在一定程度上决定了其抗氧化能力，与动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病的发病密切相关。James等［7］发现PON⁃1基因启动子 T⁃107C多态性强烈影响着PON⁃1的基因表达和血清水平，其中低表达基因型TT与血清低水平PON⁃1明显相关。在对氧磷酶1基因编码区还存在两种常见的基因多态性，分别是 CGA／CAA置换导致 192位 Arg／Gln多态性（Q192R）和 ATG／TTG 颠换导致 54位 Met／Len多态性（L55M）。已有研究证实，PON1192Q／R基因型和酶活性与脑梗死的发生有关，但也有研究认为两者无关，研究结果的差异，可能与种族、地理、实验方法、取样本量的大小等因素有关。Ranade等［8］在一项2500例的大样本研究中发现：PON1192Q／R基因型与脑卒中显著相关，QR杂合子的OR值为2.28，RR纯合子的OR值为2.47。因此得出结论PON1192Q／R基因型是脑梗死重要的危险因素。而Ueno 等［9］对日本人的研究发现：PON1192Q ／R 基因型的分布，在脑梗死患者中无差异。本实验结果显示脑梗死组与对照组之间Q192R基因型和等位基因频率差异无显著性。与Ueno结果一致，可能是PON1192Q／R基因型对脑梗死的影响常被种族、环境等因素所干扰。研究显示55多态性纯合子LL基因型与颈动脉变异的高发生率和严重程度相关，该基因型是AS性心血管疾病的独立危险因素。本次实验中发现本地区汉族人群PON1L／M55只存在LL、LM两种基因型，以LL基因型为主，正常对照人群LL基因型占95%，L／M等位基因频率分别为0.975和0.025。而以往报道在欧美白种人群中，L／M等位基因频率为 0.6～0.7／0.3 ～ 0.4［9-10］，亚洲华人和日本人 L／M 等位基因的频率为0.92／0.0816。相比较可发现本地区汉族人L／M等位基因分布趋势与国外报道的华人和日本人群的分布基本相一致，但L等位基因频率较高，M等位基因频率较低，在脑梗死组合并高血压与对照组及无高血压组的对比研究中亦发现，PON155M等位基因有明显差异，说明M等位基因不仅是脑梗死发生的危险因素，更是脑梗死合并高血压的危险因素之一。提示PON1L／M55基因分布可能由于不同的遗传背景而存在明显种族和个体差异。

本研究结果表明PON1 L55 M等位基因可能与脑梗死合并高血压患者的危险性增高有关，与国内外某些研究结果不一致，可能是因为入选人群所处地理环境、饮食习惯及种族之间差异影响了PON基因型及基因频率的分布，并且样本量较少时有可能低估某些在人群中出现频率相对较低的基因型在生化指标和临床表型方面的影响。PON基因多态性及其基因变异在动脉粥样硬化过程中的确切作用机制尚有待于更深入的研究，明确他们之间的关系将为动脉粥样硬化性疾病的早期诊断及防治提供一条有意义的途径，可为缺血性脑血管病的基因诊断、疾病预防和基因治疗提供参考依据。

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