局灶性脑缺血大鼠预处理后CHOP mRNA及其蛋白的表达☆

胡跃强 唐农 董少龙 刘尊敬 祝美珍 胡玉英 范立雷

脑缺血预处理（brain ischemic preconditioning，BIP）是近年发现的重要内源性神经保护机制，可使脑组织对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受［1］。最近有研究发现内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在此环节中发挥了关键作用，其中 C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）表达的增加是ERS的标志之一，它参与了细胞凋亡的过程［2］。本研究意在通过检测局灶性BIP后CHOPmRNA及其蛋白在脑内的表达变化，以进一步研究BIP的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理 健康雄性SD大鼠180只，体质量（250±50）g，随机将大鼠分为3组：假手术组（SO）、大脑中动脉缺血组（MCAO）、脑缺血预处理组（BIP）。 每组按照再缺血后 12 h、1 d、2 d、3 d四个时间点平均分为4个亚组（n=15）。分别作如下处理：SO组：以假手术代替预缺血及缺血再灌注；MCAO组：以假手术代替预缺血，其余步骤同BIP组；BIP组：MCAO 10 min后抽出栓线，完成预缺血，3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d 处死大鼠。

1.2 动物模型与标本制备 参照Longa的线栓法进行造模。采用大脑中动脉二次线栓法［3］制备大鼠脑缺血预处理模型，结扎左侧颈外动脉远端，在结扎线近端距分又5 mm处剪口，将尼龙线从颈外动脉残端插入至颈总动脉分叉部以上19～20 mm，结扎颈外动脉近心端，10 min后抽出栓线，完成缺血预处理。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后规定时间点处死动物取脑。

1.3 缺血半暗带脑皮质 CHOP mRNA表达测定 原位杂交法。按试剂盒说明进行操作。采用HMIAS⁃2000高清晰彩色病理图像分析系统测定CHOP mRNA原位杂交染色的灰度值。主要在顶叶缺血半暗带阳性细胞做比较，染色越深，灰度值越小，mRNA表达越多。每张切片测定4个视野（400×），取平均值。

1.4 缺血半暗带脑皮质内CHOP蛋白表达测定 大鼠断头取脑并分离缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，研磨后加入蛋白裂解液，然后4℃12000 r／min 离心 30 min，提取总蛋白，取蛋白样品 40 μg经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后电转移至PVDF膜上。然后依次加入兔抗CHOP抗体（Bioworld公司），4℃ 孵育过夜；偶联有辣根过氧化物（HRP）羊抗兔IgG（Amersham公司）室温孵育2 h，滴加ECL显色液，Bio⁃Rad凝胶成像仪曝光、显像。采用HMIAS⁃2000高清晰度彩色病理图文分析系统进行图像分析，获取各组Western blot条带的平均光密度（OD）值，内参为GAPDH，目的蛋白与内参光密度比值即为目的蛋白的相对值。

1.5 神经细胞凋亡率检测 大鼠迅速断头取脑，分离缺血半暗带脑组织100 mg，1.25 g／L胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，70%乙醇4℃过夜固定样品，次日离心弃乙醇收集细胞，加入50 mg／L RNase，37℃孵育 30 min，再加入 50 mg／L PI（美国 KPL 公司），4℃避光染色30 min，300目筛网过滤，利用美国贝克曼-库尔特FC 500流式细胞仪计数10000个细胞，测定各期细胞DNA含量并计算凋亡细胞所占比例。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0处理数据。所有数据以表示，组间比较用方差分析进行检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CHOP mRNA表达变化 原位杂交显示：SO组有少量CHOP mRNA表达；MCAO组大鼠脑缺血再灌注后12 h缺血半暗带CHOP mRNA表达达高峰（P＜0.01），随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但仍保持较高表达水平 （P＜0.01）；BIP组缺血后各时间点其表达水平较MCAO组均明显下降（P＜0.05）。 见表 1、图 1。

表1 大鼠顶叶皮层CHOP mRNA表达的灰度值

图1 缺血半暗带CHOP mRNA的表达（原位杂交）

2.2 CHOP蛋白表达的变化 Western blot显示：SO组有少量CHOP蛋白表达；MCAO组12 h缺血半暗带CHOP蛋白表达开始显著增加，24 h达高峰（P＜0.01），随再灌注时间延长其表达逐渐下降，但仍保持较高表达水平（P＜0.01）；BIP组缺血各时间点其表达水平均显著降低（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。见表 2、图 2。

表2 大鼠顶叶皮层CHOP蛋白表达的光密度值

图2 CHOP蛋白的表达（Western blot）

2.3 神经细胞凋亡率变化 流式细胞术细胞周期定量分析表明，SO组未见明显的凋亡峰，其细胞凋亡百分率很低。脑缺血再灌注12 h后，MCAO组缺血半暗带细胞凋亡发生率较SO组显著增加（P＜0.01），1 d时达到高峰，以后时间点逐渐下降，但仍高于SO组（P＜0.01）；BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。说明BIP具有减轻脑缺血再灌注后神经元凋亡的作用。见表3。

3 讨论

脑缺血预处理（BIP）是指对脑组织采用机械刺激，如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受，这种现象又称为脑缺血耐受。最近有研究发现BIP可激发适当的内质网应激（ERS），增强细胞耐受后继长时间缺血刺激的能力，延缓或减轻I／R造成的组织损伤，并认为ERS可能是脑缺血细胞损伤的关键环节［4］。脑缺血后ERS激活并可诱导CHOP／Gadd153等未折叠蛋白反应 （UPR）靶基因在缺血后表达［5］，引起细胞凋亡。其可能机制如下：①内质网跨膜蛋白IRE1和ATF6活化［6］，其胞浆活性部分进入核内，与ERS反应元件相连，启动CHOP转录与表达［7］；②通过PERK-eIF2a途径活化，导致转录因子ATF4和ATF3表达，前者结合氨基酸调控元件，再诱导CHOP表达。CHOP可能通过下调Bcl-2表达、耗竭谷胱甘肽、促进活性氧族产生等，活化Caspase-12，最终导致细胞凋亡［8］。CHOP基因敲除可增强细胞对抗ERS所致凋亡的能力；相反，CHOP过度表达的细胞则对ERS所致凋亡更为敏感。

表3 各组大鼠神经细胞凋亡率

己有研究在脑缺血再灌动物模型中检测出CHOP表达增加。如Yuan等［9］制作大鼠短暂性全脑缺血模型，阻断脑血流30 min后再灌注，结果显示再灌注6 h至24 h大脑皮层缺血半暗带CHOP蛋白表达逐渐增加，再灌注24 h达高峰；Jin等［10］利用微阵列分析技术发现大鼠海马部位CHOPm⁃RNA 在再灌注 4 ～ 24 h 表达增加；Tajiri等［11］将野生型及CHOP-／-小鼠制成永久性脑缺血模型，检测CHOPmRNA及其蛋白在野生型小鼠纹状体及海马的表达以，实验发现术后12 h CHOPmRNA表达显著增加，术后24 h在受损神经元胞核内检出CHOP蛋白表达，而CHOP-／-小鼠7 d后海马和纹状体的神经细胞死亡较对照组有实质性的减少，这些结果均说明缺血诱导的神经细胞死亡与CHOP有关。

本研究发现，脑缺血120 min再灌12 h缺血侧顶叶皮层CHOPmRNA表达达高峰，随再灌注时间延长其表达逐渐下降，再灌注72 h仍可见其高表达，其蛋白表达于再灌24 h达高峰，提示大鼠缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤诱发的ERS可诱导CHOP的表达。与相关研究报道基本一致［9-10］。结合神经细胞凋亡率在I／R后1 d时达到高峰，提示I／R后CHOP表达上调促进了细胞凋亡。而BIP干预后其表达均有明显的下降，提示BIP可能通过影响ERS后CHOP的表达而抑制细胞凋亡，从而保护神经细胞。其机理有待于进一步研究。

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