木霉菌株TC-14对苗木立枯病菌的室内外抑制效果

邓 龙 尹大川 邓 勋 宋瑞清*

(1.黑龙江省林科院，哈尔滨 150081；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040)

苗木立枯病(seedlingdamping-off)又称苗木猝倒病，由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起。是苗圃普遍发生、危害严重的苗期病害，主要发生在1～3a生苗木上，特别是出苗1月以内、未木质化的苗木受害最重[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中资源丰富的拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制性的特点[2]。首先,木霉菌竞争作用强,它能迅速生长,进行营养和空间位点的竞争。它能产生挥发性或非挥发性的抗菌类次生代谢产物, 如木霉素、胶霉素、绿色木霉素和抗菌肽等,对多种病原菌有抑制作用；此外还具有重寄生作用,通过胞外酶破坏病原菌细胞壁，削弱病原菌的生长势,甚至杀死病原菌。目前世界范围内有多个以木霉为主要成分的生物杀菌剂，在农林业生产中发挥重要作用[3]。同时，木霉还具有促进植物生长、提高抗逆性的作用[4]。本研究利用木霉菌株TC-14对苗木立枯病菌进行室内外生测，为进一步研究木霉对苗木立枯病菌的抑菌机理并开发具有较高稳定性的生物农药奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

(1)木霉菌株：菌株TC-14，保存于东北林业大学森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：苗木立枯病菌—立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，保存于东北林业大学林学院森林微生物研究中心。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株TC-14对苗木立枯病菌的抑制效果

(1)菌株对苗木立枯病菌的拮抗作用。

采用平板对峙培养法[5]。在PDA平板培养基上，相距5cm分别接种直径0.5cm木霉菌株和病原菌株菌饼。以木霉菌株和病原菌株单独培养作为对照，置于25℃恒温培养箱中培养。每处理3次重复。每8h测量一次菌落半径。计算被抑制率、菌丝生长速度和相对抑制效果，观察拮抗线有无，统计竞争系数。

对峙培养中竞争系数分级标准见表1。

表1 菌株对峙培养中竞争系数分级标准

被抑制率(%)=(对照菌落直径-对峙培养菌落直径)/对照菌落直径×100%

相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)非挥发性代谢产物对立枯病菌的抑制作用。

非挥发性代谢产物制备：无菌条件下，用0.5cm打孔器切取PDA平板培养基上生长3d的木霉菌落，接种到在300mL PD培养基中，每瓶3片。恒温振荡培养(25℃，150r/min)7d。8层纱布过滤后，取滤液，减压旋转蒸发浓缩到原体积的1/10，备用。

抑菌活性测定：采用生长速率法。将非挥发性代谢产物添加到PDA培养基中，摇匀，使终浓度达到20%，倒平板，待冷却凝固后，接入病原菌，以不添加代谢产物的PDA平板培养作为对照，25℃恒温培养5d。采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算木霉非挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率，每处理3次重复。

1.2.2 木霉菌株TC-14野外应用研究

试验地位于黑龙江省苇河林业局西林林场苗圃，供试苗木为落叶松1a生苗木。

TC-14防治菌剂采用浓度为3.5×109/mL的孢子悬浮液和发酵液原液，分别设置4个浓度梯度，以空白作为对照，采用灌根法进行防治。每个处理1个苗床(1m×20m)，2个重复。2011年5月5日和2011年5月20日防治2次。防治30d后(6月20日)调查防治效果以及苗木株高。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株TC-14对立枯病菌的抑制效果

2.1.1 拮抗效果

对峙培养48h后，菌株TC-14对3种立枯病菌生长的相对抑制效果均超过1(表2，图1)。木霉菌株生长速度快，竞争系数高，在同苗木立枯病菌的对峙培养中，迅速占领生态位，最终覆盖病原菌或形成较为明显的拮抗线，病原菌在木霉菌的作用下几乎停止生长，并最终被木霉菌所覆盖。

表2 木霉菌株TC-14对苗木立枯病菌的抑制效果

2.1.2 次生代谢产物抑菌效果

TC-14次生代谢产物对3个病原菌株均有一定的抑制效果(表2，图2)。其中，对立枯丝核菌的抑菌率最高，为89.26%。病原菌在平板上菌丝稀疏，生长明显变弱甚至不生长。该结果与前面的对峙实验结果相吻合。

2.2 木霉菌株TC-14的野外应用效果

利用木霉菌株TC-14制作的菌剂(孢子粉剂和液体菌剂)对苗木立枯病具有显著的控制效果(表3)，各菌剂防治效果均接近或高于80%。不同浓度梯度菌剂的防治效果存在一定的差异。孢子粉剂防治效果高于液体菌剂。TC-14孢子粉剂10倍液对苗木立枯病防治效果达到88.6%。

表3 木霉菌剂野外防治效果

木霉菌株TC-14孢子悬浮液和液体菌剂对落叶松苗木的生长均有不同程度的促进作用(图3)。灌根30d后，液体菌剂10倍液对落叶松苗木高生长促进效果最高，与对照相比高生长提高30.2%。两种剂型的50倍液对苗木生长均表现出抑制。

3 结论

通过木霉菌株TC-14对苗木立枯病菌的室内外生物测定结果，得出以下结论：菌株TC-14对立枯病菌有一定的拮抗作用，非挥发性代谢产物中含有高效抑菌活性成分，对立枯病菌具有明显的控制效果。TC-14孢子悬浮液10倍液野外防治效果最好，液体菌剂10倍液对落叶松苗木高生长促进效果显著。

参考文献：

[1]马存世,刘正祥.针叶苗木立枯病综合防治技术[J].甘肃科技，2006，22(9)：221～222.

[2]朱廷恒，邢小平，孙顺娣.木霉T97菌株对几种植物病原真菌的拮抗作用机制和温室防治试验[J].植物保护学报，2004,31(2)：139～144.

[3]Francesco V., Krishnapillai S., Emilio L. Trichoderma-plant-pathogen interactions[J].Soil Biology & Biochemistry,2008,(40):1～10.

[4]F. Vinale, K. Sivasithamparamb. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2008，(72):80～86.

[5]Morton, D.T., Stroube, N.H. Antagonistic and stimulatory eVects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology,1955,(45):419～420.

[6]宋漳，陈辉.绿色木霉对土传病原真菌的体外拮抗作用[J].福建林学院学报,2002,22(3):219～222.