难治性癫痫患者致痫灶中CX43的表达

张立志 冯俊强 陈晶 宋宏杉 陈业鹏

癫痫(epilepsy，EP)是神经系统常见疾病之一，目前仍以药物治疗为主，约有80%的患者经过系统的抗癫痫治疗症状可缓解或治愈，但仍有20%左右对现有药物治疗无效，成为难治性癫痫［1］。癫痫的发病机制涉及诸多方面，其中神经元之间的联络在癫痫发作中也起重要作用。神经元之间最简单的信息传递形式是电突触，而缝隙连接(gap junction，GJ)是神经元电突触的基本结构［2］，所以缝隙连接、缝隙连接蛋白(connexin，CX)与癫痫的关系倍受研究者的关注。目前针对GJ与癫痫的研究很多，但难治性癫痫患者致痫灶脑组织CX43的表达情况鲜有报道。本研究利用免疫组织化学方法观察24例难治性癫痫患者手术切除的致痫灶脑组织及因脑外伤手术切除的正常脑组织中CX43的表达情况，并进行比较。进一步阐明CX43形成的缝隙连接在癫痫活动中的作用，为难治性癫痫的临床研究及治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 24例难治性癫痫手术患者中，男12例，女12 例，男女比例1∶1。年龄17 ～58 岁，平均(28.3±11.1)岁，近3个月发作频率5～40次/月，平均(15.3±11.8)，患者病程2～29年，平均(8.3±7.8)。全部病例病史均在二年以上，经过两种或两种以上抗癫痫药物系统治疗，癫痫发作每个月4次以上，经影像学、头皮长程脑电图或颅内皮层脑电图监测明确致痫灶，具有手术指征者。所有患者均在皮层电极监测下行致痫灶切除手术，切除病灶有额叶、颞叶、枕叶、海马。术后病理证实为:脑组织皮质分层紊乱，神经元分布不均，胶质细胞增生。对照组脑外伤急诊手术6例患者，女2例，男4例，男女比例2∶1。年龄17～55岁，平均(36.5 ±16.8)岁，均无癫痫发作及癫痫病史。

1.2 标本制作及脑组织中CX43表达的检测 采集实验组24例及对照组6例手术切除脑组织，切块并分别置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液和2%～3%戊二醛中固定。①免疫组织化学法检测(SP法):标本行石蜡包埋、切片、脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，3 min/次。对组织抗原进行热修复:pH6.0、0.01 mmol/L的柠檬酸抗原修复液中煮沸15 min。应用SP超敏试剂盒按照说明进行操作。应用DAB试剂盒配制DAB液，每张切片加100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3 min。自来水冲洗，苏木精复染。自来水冲洗返蓝。切片经过75%、80%、95%、95%、100%酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。实验组与对照组分别于400倍光学显微镜下，随机选取5个视野，记录镜下阳性细胞数，取其均数。

2 结果

免疫组化方法检测致痫灶脑组织CX43的表达 实验组及对照组脑组织中均检测到CX43的阳性细胞，主要分布在细胞膜和细胞浆，经DAB染色，神经细胞胞浆及胞膜显棕色，因不同脑区脑皮质细胞形态不同，故免疫反应阳性细胞的形态也不相同，癫痫患者脑皮质CX43抗体阳性细胞数均明显增多，而正常脑皮质细胞胞浆及胞膜CX43抗体阳性细胞表达稀少(见表1，图1～2)，差异有统计学意义。

表1 两组患者脑组织中CX43阳性细胞的表达(±s)

表1 两组患者脑组织中CX43阳性细胞的表达(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.001

组别 例数CX43对照组612.0 ±7.0实验组 24 50.5 ±9.7*

图1 对照组少量CX43阳性细胞表达(400倍)

图2 实验组CX43阳性细胞表达增多(400倍)

3 讨论

缝隙连接是由邻近两个细胞细胞膜上相对应的半通道(hemichannel)对接而成，是目前所知细胞间惟一能直接交换物质和信息的通道［3］。而细胞间通过GJ为途径直接进行的细胞间的信息交流成为缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication，GJIC)。GJ的基本结构单位是连接子(connexon)或称半通道。连接子是由六个缝隙连接蛋白寡聚成的一种中空的亲水性的环状六聚体结构［4］。GJ中的半通道直径约1.5nm，允许分子量小于1.0 kD和直径小于1.5nm的小分子物质通过，如代谢分子、离子、第二信使(Ca2+，IP3，cAMP 和 ATP)及代谢产物如葡萄糖等通过［5］。CX是一类具有高度保守性的，由多基因编码的膜蛋白［6］。CX的组织分布具有一定的特异性，而且不同CX组成的半通道可以相互配对排列组成不同种类的细胞间GJ。不同细胞细胞膜上GJ的种类及数目分布不同，其功能也不相同。数个至数千个GJ在细胞膜上成簇出现则形成缝隙连接斑(gap junction plaque)，GJ的数量决定着斑块的大小以及GJIC的强度［7，8］。有11 种 CX 在中枢神经系统中表达，分别为 Cχ26，Cχ29，CX30，CX32，CX36，CX37，CX40，CX43，CX45，CX46 及CX47［9］。目前在中枢神经系统中研究较多的为 CX32及CX43，CX43在中枢神经系统表达最强，主要分布在星形胶质细胞上［10］，CX32在神经系统分布最多，主要在少突神经胶质细胞表达，同时在大脑皮质、海马的锥体细胞、颗粒细胞、中脑和基底节神经元中也有较多的表达［11］。

有研究表明，在癫痫发作敏感动物的脑皮质中，神经元数目减少，而星形胶质细胞数目明显增加，体积变大，突触增多，并且相邻星形胶质细胞之间GJ增多，与其相关的细胞因子也随之发生变化。几乎所有癫痫患者或动物模型脑组织中的星形胶质细胞，在形态、功能、数量上均有明显改变。最近研究指出星形胶质细胞在中枢神经系统发挥重要的生理功能，如神经元的同步放电、离子平衡、神经递质的调节、葡萄糖的代谢和调节血管张力等［12，13］。星形胶质细胞通过缝隙连接相互偶联，能够缓冲神经元兴奋时释放到细胞外的大量K+，维持了神经元细胞外环境的稳定［14］。现在越来越多的证据表明，功能失调星形胶质细胞在癫痫中发挥着关键作用［12］。CX43在星形胶质细胞上分布最多，其形成的缝隙连接，在胶质细胞间广泛存在。在许多癫痫的研究中发现，CX43表达上调及GJ偶联增加，Fonseca等观察采用免疫荧光标记的胶原纤维酸性蛋白(GFAP)以及应用CX43抗体标记癫痫患者和健康人海马组织，发现癫痫患者海马组织中，不但星形胶质细胞间GJ偶联进一步扩大，其CX43蛋白表达也明显增加，提示上调星形胶质细胞CX43的表达能够进一步加重全面性癫痫发作。且CX43的表达强度受癫痫持续时间的影响，癫痫时间愈长，CX43 的表达就愈多［15］。Nakase等［16］将敲除CX43基因的小鼠与CX43表达正常的小鼠在局灶性脑缺血后比较，发现CX43缺乏的小鼠凋亡细胞增多，表明GJ对凋亡有抑制作用。CX43可能与致痫后脑组织重塑有密切关系。由此我们可以推测星形胶质细胞上的GJ参与了癫痫活动，CX43对癫痫的发展中起到一定作用。

本实验通过免疫组织化学及免疫电镜方法对癫痫患者脑组织中CX43的表达进行观察，结果显示实验组及对照组脑组织中均检测到CX43的阳性细胞，实验组脑组织CX43阳性细胞数为(50.5±9.7)，而对照组 CX43阳性细胞数为(12.0±7.0)，差异有统计学意义。CX43在难治性癫痫致痫灶脑组织中的表达增加，提示缝隙连接参与了癫痫的发生及发展，在脑皮质发育、神经网络及环路的重组、神经细胞间离子通道的构成等方面发挥着重要作用。

［1］徐姜定.难治性癫痫治疗进展.浙江临床医，2006，8(10):1009-1010.

［2］姚伯昕.缝隙连接与癫痫.海南医学，2009，20(6):132-135.

［3］Nakagawa S，Maeda S，Tsukihara T.Structural and functional studies of gap junction channels.Curr Opin Struct Biol，2010，20(4):423-430.

［4］Goodenough DA，Paul DL.Gap junctions.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1(1):2576.

［5］Meldrum BS，Rogawski MA.Molecular targets for antiepileptic drug development.Neurotherapeutics，2007 4(1):18-61.

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［7］Goodenough DA，Paul DL.Gap junctions.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1(1):2576.

［8］Orthmann-Murphy JL，Abrams CK，Scherer SS.Gap junctions couple astrocytes and oligodendrocytes.J Mol Neurosci，2008，35(1):101-116.

［9］Meldrum BS，Rogawski MA.Molecular targets for antiepileptic drug development.Neurotherapeutics，2007，4(1):18-61.

［10］Chew SS，Johnson CS，Green CR，et al.Role of connexin43 in central nervous system injury.Exp Neurol，2010，225(2):250-261.