葛根素水溶液对酒精性脑病的药理作用

鞠文博 曲智威 周 艳 (北华大学组胚教研室，吉林 吉林 3203)

酒精中毒可导致机体很多器官发生病变，亦可以导致严重的神经系统症状，以四肢及舌震颤、癫样发作、共济失调居多〔1〕。长期大量饮酒可带来大脑结构持久性或可逆性改变，有人对酒精成瘾者尸检发现，有半数以上的病人合并有脑萎缩和神经细胞变性、脱髓鞘及胶质细胞增生〔2〕。因此，酗酒和酒精中毒对大脑的损害成为世界性的研究课题〔3〕。葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取的一种化学成分，其化学名为8-β-D葡萄吡喃糖-4，7二羟基异黄酮〔4〕。药理实验研究表明，葛根素具有降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量〔5〕;对心肌的保护作用，对肾的保护作用，抗氧化作用，抗缺血再灌注损伤的作用〔6〕;抗酒精中枢抑制作用，降血糖，防治糖尿病及其并发症，改善血液流变学指标，改善微循环和抗血小板聚集等作用〔7〕。本课题组选用了葛根素作为对抗酒精的中药进行试验研究，从中医中药角度治疗酒精性脑病提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料 30只Wistar大鼠，雄性，体重 (180±20)g(由吉林大学的实验动物所提供)，50%葡萄糖，葛根素，酒精，显微摄像系统 (Olympus)，离心机，组织匀浆机;肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫试剂盒 (由深圳晶美生物工程有限公司提供);全自动酶标仪 (美国BIO-TEK 800型);鲎试剂盒 (北京中山生物技术有限公司)。兔抗鼠环氧化酶-2(COX-2)多克隆抗体 (美国Cayman公司);小鼠抗大鼠β-肌动蛋白 (β-actin)单克隆抗体 (美国Sigma公司);生物素标记的羊抗兔二抗 (英国KPL公司)，辣根过氧化物酶标记羊抗兔及羊抗鼠二抗、增强化学发光剂 (ECL，北京中山生物技术有限公司)，硝酸纤维素膜 (北京鼎国生物技术有限责任公司)，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法 动物分组：30只Wistar大鼠，随机分为3组，每组10只。对照组用50%葡萄糖20 ml·kg－1·d－1灌胃，模型组用40%酒精按 8 g·kg－1·d－1灌胃，葛根素组：葛根素水溶液10 mg·kg－1·d－1灌胃给药5 min后，酒精灌胃，酒精量同模型组。给药30 d造模结束后，采用巴比妥钠麻醉、腹主动脉采血后处死大鼠。

1.3 内皮素(ET)检测 用偶氮显色法定量检测和葛根素组大鼠血浆中的ET水平(依据试剂盒说明检测)。

1.4 脑组织TNF-α检测 抽血后，断颈处死各组大鼠，在无菌条件下，剖开颅脑，切取大脑组织，生理盐水洗净备用。取一小块大脑组织称取湿重后，按W∶V为1∶5的比例加入生理盐水，用组织匀浆机搅拌成脑匀浆。将匀浆置于离心管中，以4 000 r/min离心20 min，取上清液，用ELISA法检测各组脑组织匀浆中TNF-α的含量(依据试剂盒说明检测)。

1.5 COX-2表达检测 使用Western印迹方法检测脑组织COX-2表达。取冷冻的脑组织称重后按1∶10比例用三去污蛋白裂解液裂解，10 000 r/min离心5 min，2次，取上清。用考马斯亮蓝(G250)测定蛋白含量。以每样品总蛋白为150 μg上样，用不连续10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转蛋白至硝酸纤维素膜：10%脱脂奶粉封闭;一抗4℃过夜;Ris缓冲液(TBS)洗膜;辣根过氧化物酶标记二抗37℃2 h，TBS洗膜，ECL作用后X胶片曝光，经显影、定影等处理后观察结果。并用Bandscan软件作灰度扫描分析，用COX-2与内参β-actin灰度值比值表示各样本COX-2表达强度，并作统计学处理。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.5统计软件进行分析，数据资料以s表示，采用T检验分析

2 结果

2.1 一般情况 对照组被毛光滑，精神状态好，食欲佳，体重增加。模型组的大鼠精神萎靡，活动减少，食欲减退，消瘦，皮毛无光泽，有脱毛现象，体重较前有所下降。葛根素组的大鼠精神、食欲及活动和对照组无明显差异。

2.2 血浆中ET的含量 模型组血浆中ET含量明显高于对照组和葛根素组，葛根素组和对照组无差异。见表1。

2.3 脑组织匀浆中TNF-α含量 模型组的脑组织匀浆中TNF-α的含量明显高于对照组，葛根素组和对照组差异不显著。见表1。

表1 葛根素组和对照组及模型组的大鼠血浆中ET含量和脑组织匀浆中TNF-α含量比较(s)

表1 葛根素组和对照组及模型组的大鼠血浆中ET含量和脑组织匀浆中TNF-α含量比较(s)

与模型组比较：1)P＜0.05

组别 n ET(Eu/ml)TNF-α(ng/g)对照组 10 0.302±0.078 10.73±0.361)葛根素组 10 0.503±0.128 12.73±0.381)模型组 10 0.812±0.126 16.68±0.432)

2.4 脑组织COX-2表达 对照组呈弱表达，模型组显著高表达，与对照组比较差别显著(P＜0.01)。葛根素组COX-2表达下调，与模型组相比有明显下调(P＜0.01)。经计算机Bandscan软件分析其灰度值，COX-2灰度值与β-actin灰度值比值为：对照组为0.196±0.079，模型组为0.421±0.033，葛根素组为0.281±0.046。见图1。

图1 脑组织COX-2表达结果

3 讨论

长期大量饮酒带来的损伤是广泛的，包括消化系统的溃疡、严重的肝脏的损害、肾脏的损骇以及循环系统的损害等多器官、多系统的损害，更加严重的是神经系统的损伤，表现为一系列思维及行为释放状态，如患者理智障碍、易冲动、共济失调、语无伦次、呕吐、嗜睡等，因大脑急性缺氧，重者可引起癫痫、抽搐甚至死亡。酒精性肝损伤与ET血症具有相关性，原因可能是饮酒后，一方面造成肠道菌群失调，革兰阴性菌产生增多，肠源性ET增多;另一方面，酒精可致肠壁通透性增加，进而ET吸收入血增加，导致肠源性ET血症;而ET可直接引起血脑屏障通透性增加，诱使脑微血管出现凝血功能紊乱，造成脑组织缺氧，以及诱导脑组织中TNF-α的升高，从而使脑组织发生炎性水肿〔8〕。ET致细胞因子在大鼠脑水肿中表达增加已有研究证实〔9〕。研究发现，TNF-α是使血管内皮细胞黏附分子表达上调的重要细胞因子，能够引起白细胞趋化，破坏血脑屏障，兴奋氨基酸受体，并刺激胶质细胞产生大量的NO，从而造成脑水肿〔10〕。

本实验结果说明葛根素能够对抗酒精对大鼠脑组织损伤的影响，其机制可能是在急性酒精中毒的情况下，葛根素可以改善血液循环，增加组织氧供，有利于酒精的氧化代谢;通过扩张血管，改善肾小管的痉挛状态而增加肾血流量，尿量增加，排泄增强，从而降低血液中乙醇水平，减少肠道对酒精的吸收，从而减少血液中含ET量的增高，减少脑组织炎性因子TNF-α的增加，从而减少脑组织发生炎性水肿，降低对脑组织的损伤。

COX是前列腺素类(PGs)物质合成过程中的一个限速酶。COX-2亚型在正常组织中不表达或低表达，但在炎症、肿瘤等病理状态下，可受众多因素的刺激，其表达明显升高〔11〕。本实验结果表明：葛根素组COX-2表达与模型组相比有明显下调。

本项研究结果证实，葛根素具有减少机体对酒精的吸收，减轻酒精对脑组织的损伤作用，其作用机制主要是减少ET的吸收，从而减少脑组织中TNF-α及COX-2含量，减轻了对脑组织的损伤。

1 马毓芬.141例慢性酒精中毒患者临床资料分析〔J〕.地方病通报，2007;22(4)：100.

2 赵大志.慢性酒精中毒31例临床分析〔J〕.中华医学研究杂志，2006;6(8)：908-9.

3 朱 江，邬于川.大鼠酒精性脑损伤组织中TNF-α的表达〔J〕.四川医学，2006;2(2)：117-8.

4 Seitz HK，Stickel F.Alcoholic liver disease in the elderly〔J〕.Clin Geriatr Med，2007;3723(4)：905-21.

5 Tan Y，Liu M，Wu B.Puerarin for acute ischaemic stroke〔J〕.Cochrane Database Syst Rev，2008;23(1)：4955.

6 刘 瑞，孟 芳，白 怀，等.槲皮素、芦丁及葛根素抑制LDL氧化修饰作用的研究〔J〕.中国中药杂志，2007;32(19)：2058-62.

7 Hwang YP，Choi CY，Chung YC，et al.Protective effects of puerarin on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity〔J〕.Arch Pharm Res，2007;30(10)：1309-17.

8 蒋业贵，李兆中.酒精性肝病发病机制的研究进展〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2003;12(5)：484-6.

9 王怀立，高东培，芦军萍.TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠脑水肿中的表达〔J〕.免疫学杂志，2002;18(6)：440-2.

10 Samaka RM，Abdou AG，Abd El-Wahed MM，et al.Cyclooxygenase-2 expression in chronic gastritis and gastric carcinoma，correlation with prognostic parameters〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst，2006;18(4)：363-74.

11 Harada N，Okajima K，Uchiba M，et al.Antithrombin reduces ischemia/reperfusion-induced liver injury in rats by activation of cyclooxygenase-1〔J〕.Thromb Haemost，2004;92(3)：550-8.