小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用

李宝善 王艳娇 马厚勋 吴 平 (重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 400016)

小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用

李宝善 王艳娇 马厚勋 吴 平 (重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 400016)

目的 克隆编码小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段，构建、包装Klotho重组腺相关病毒表达体系，并检测rAAV/mKL载体表达功能。方法 选择RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白的基因片段，将该片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-IRES-hnGFP，采用酶切及DNA测序鉴定;利用AAV-293细胞包装rAAV/mKL，经转染7901细胞，检测其Klotho表达情况。结果 本文成功克隆出序列信息和读码框完全正确的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段，并构建pAAV/mKL克隆。在AAV-293细胞中包装出rAAV/mKL，病毒原液转染7901细胞后其Klotho mRNA表达上调，而细胞上清液Klotho蛋白也明显增加(P＜0.01)。结论 成功构建小鼠Klotho重组腺相关病毒载体(pAAV/mKL)，获得了rAAV/mKL，并经转染7901细胞验证其基因表达功能正常，这就为进一步研究Klotho基因治疗衰老相关性疾病提供了技术基础。

Klotho;基因克隆;腺相关病毒;载体构建;病毒包装

目前研究证实分泌型的KL蛋白实质上是膜型KL蛋白细胞外区可被锚定在细胞膜上的如ADAM10和ADAM17等金属蛋白酶水解脱落而产生的〔1，2〕，其作为一种循环因子或激素，可抑制细胞内胰岛素/胰岛素样生长因子-1(insulin/IGF-1)信号级联放大效应〔3〕，而Klotho蛋白抑制胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导的能力可能与其抗衰老特性有关。另外分泌型klotho还具有调节离子通道活性，抑制氧化应激、抑制Wnt信号转导以及增加一氧化氮合成等作用〔4，5〕。新近国外研究证实在自发性高血压大鼠应用全长Klotho cDNA腺相关病毒递送能够阻止其病程进展和血压增高以及肾脏损害〔6〕，其作用可能是通过增加Klotho表达来实现的，这提示重组Klotho cDNA腺相关病毒载体转染可为高血压长期控制和肾脏保护治疗提供一条新途径。现有研究证实分泌型的Klotho蛋白实质上就是全长膜型Klotho蛋白(mKL)蛋白细胞外区的水解脱落成分，为此，本研究拟通过采用更优化的实验方法克隆编码mKL蛋白cDNA，并构建其重组腺相关病毒载体，以便为后续研究Klotho基因治疗高血压、2型糖尿病、原发性骨质疏松等衰老相关性疾病提供技术条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及质粒载体和菌株 5周龄昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。pMD19-T载体由TaKaRa公司生产，腺相关病毒质粒载体 pAAV-IRES-HnGFP、AAV-RC、AAV-Helper为Stratagene公司产品。TOP10感受态细胞为重庆市眼科学重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 PCR产物加A尾试剂盒、DNA Marker、T4 DNA连接酶为TakaRa公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。基因测序由上海英潍捷基公司、宝生物(大连)公司完成。Lipofectamine 2000购自英潍捷基(上海)公司，DMEM高糖培养基、1640培养基、胎牛血清购自Hyclone公司。小鼠Klotho蛋白ELISA试剂盒为R＆D分装产品。

1.1.3 主要仪器 Nano Drop2000微量分光光度计(Thermo)，s1000 PCR仪、DNA电泳凝胶成像系统(Bio-Rad)，Leica ebq100倒置荧光显微镜，HEPA Class100恒温细胞培养箱(Thermo)。本实验研究所需的实验场地及仪器均为重庆市眼科学重点实验室提供。

1.2 方法

根据分子生物学技术方法并在国内赵景宏等〔7〕文献报道的两步法基础上，建立和完善了更有效、切合实际、条件优化的实验技术方法与操作规程，确保本实验方法的可行性。

1.2.1 小鼠的肾脏组织总RNA提取 取约100 mg小鼠肾脏组织按RNAiso Plus说明书提取总RNA，并溶于DEPC处理水。

1.2.2 克隆编码小鼠全长mKL蛋白的基因 用小鼠的肾脏组织总RNA，应用反转录扩增Klotho基因序列。根据本研究需要设计PCR的特异性上游引物序列为：5'ccggaattcctagcccg-3'(斜体下划线部分为EcoR I酶切位点，黑体加框部分为翻译起始密码子)，特异性下游引物序列为：5'gccgctcgagcttataacttctc 3'(斜体下划线部分为Xho I酶切位点，黑体加框部分为翻译终止密码子)(NM_013823.2)，其PCR产物长度为3 064 bp;并选择大鼠β-actin mRNA(NM_013823.2)为本研究PCR实验内参，上游引物序列为：5'GCGACGAGGCCCAGAGCAAG 3';下游引物序列为：5'TGGAGGGGCCGGACTCATCG 3'，PCR产物长度为942 bp。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定片段大小，胶回收PCR产物，加A尾，连接pMD19-T载体送上海英潍捷基公司进行DNA测序。

1.2.3 编码小鼠mKL蛋白的全长cDNA片段的获得 将测序结果正确的pMD19-T/mKL EcoR I/Xho I双酶切。胶回收3 kb左右条带，即为mKL cDNA片段，置pH7.5 TE缓冲液中，－20℃保存。

1.2.4 重组pAAV/mKL质粒的构建 应用EcoR I/Xho I对腺相关病毒空载体pAAV-IRES-HnGFP进行双酶切，胶回收目的片段，然后将酶切后载体与之前酶切回收mKL cDNA片段按1∶10(摩尔数比)进行连接，转化TOP10感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。

1.2.5 重组pAAV/mKL质粒的筛选与鉴定 经含氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落振荡培养过夜后提取质粒，通过EcoR I/Xho I酶切对重组质粒pAAV/mKL进行鉴定。最终将鉴定阳性重组质粒送宝生物生物工程公司进行DNA测序，测序结果与GenBank中所报道目的基因序列进行比对分析。

1.2.6 重组rAAV/mKL病毒包装 AAV Helper-Free System试剂盒推荐用2×HBS+0.3 M CaCl2即磷酸钙共沉淀法转染技术，而本实验研究通过探索、优化转染实验条件，发现采用Lipofectamine 2000介导转染方法，其转染率及包装效率能得到显著提高。

1.2.7 rAAV/mKL转染7901细胞后其KL mRNA表达 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培养基培养7901细胞，待细胞融合到80%，换含2%胎牛血清的DMEM培养基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后换为10%胎牛血清的1640培养基，48 h后收集细胞，按RNAiso Plus说明书提取总RNA，逆转录，用Premix Taq酶PCR验证Klotho基因表达，所用上、下游PCR引物序列分别为 5'GGGTCACTGGGTCAATCT 3'和 5'GCAAAGTAGCCACAAAGG-3'(NM_013823.2)，PCR产物长度为710 bp。内参同前。

1.2.8 rAAV/mKL转染7901细胞后其KL蛋白表达 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培养基培养7901细胞，待细胞融合到80%，换含2%胎牛血清的DMEM培养基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后换为10%胎牛血清的1640培养基，48 h后收集细胞上清液，按ELISA试剂盒说明操作。重复5次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 编码小鼠全长mKL蛋白的基因克隆与鉴定

通过对PCR的退火温度进行梯度筛选，结果显示在退火温度为56℃条件时其特异的DNA片段扩增效果最好，为此，本研究选用56℃为退火温度条件，其所得PCR产物电泳结果显示其产物长度约3 000 bp，与预期目的片段大小一致(见图1)。通过回收PCR产物，加A尾后，与pMD19-T载体进行连接、再扩增，并经EcoR I/Xho I酶切，其产物电泳结果显示目的片段成功克隆至pMD19-T即提示载体构建获得成功，随后DNA测序检测结果也表明所扩增的DNA片段序列与小鼠膜型Klotho mRNA基因序列完全一致。见图1。

2.2 编码小鼠全长mKL蛋白cDNA片段的获得

将测序结果正确的pMD19-T/mKL质粒EcoR I/Xho I双酶切，电泳结果可见大小约2 670 bp的pMD19-T片段和约3 kb的mKL cDNA，胶回收约3 kb条带，获得了编码小鼠膜型Klotho蛋白的全长cDNA片段。

2.3 重组pAAV/mKL质粒的构建与鉴定

经过酶切、连接、转化和氨苄青霉素抗性筛选，提取质粒后酶切鉴定，获得阳性重组质粒pAAV/mKL。测序结果显示，质粒中含有与GenBank和文献报道序列一致且读码框完全正确的小鼠全长膜型Klotho cDNA序列，表明小鼠膜型全长Klotho重组腺相关病毒载体构建成功。见图1。

2.4 重组AAV/mKL病毒包装

本研究将AAV-RC、AAVHelper、pAAV/mKL三质粒等比例与Lipofectamine 2000共转染AAV-293细胞。其结果显示48 h后可见绿色荧光表达即提示有病毒产生，72 h后绿色荧光最为明显，并有部分荧光淬灭(见图2)。

2.5 rAAV/mKL转染7901细胞后Klotho mRNA表达情况

病毒原液转染7901细胞48 h后收集细胞，提取总RNA。其结果显示病毒转染后7901细胞的Klotho基因mRNA表达显著增加，见图1。

2.6 rAAV/mKL转染7901细胞后Klotho蛋白表达情况

病毒原液转染7901细胞48 h后收集细胞培养上清液，应用ELISA法检测培养上清液中分泌型Klotho蛋白(来源于膜型Klotho蛋白脱落入培养液中部分)。其结果显示病毒原液转染组：(75.52±7.02)U/L，空白对照组：(46.78 ±2.64)U/L;即病毒原液转染组较空白对照组分泌型Klotho蛋白明显升高，有显著性差异(P=0.003)。

图1 PCR、酶切后凝胶电泳图

图2 共转染AAV-293细胞后GFP表达情况(×100)

3 讨论

Klotho基因是新近研究发现的一种与寿命和各种衰老相关表型(如心血管疾病、肺气肿、骨质疏松等)相关的基因，而目前有关Klotho基因与人类疾病的关系也在不断探索中。

基于本实验涉及Klotho基因片段较长，超过3 000 bp，而在现有的文献中对超长片段基因的高保真克隆方法报道甚少。为此，本实验在传统两步RT-PCR法基础上通过改良优化实验方法，实现了超长片段基因的膜型Klotho蛋白cDNA克隆之目的。

众所周知pAAV-IRES-HnGFP质粒构建时，如果插入片段过长会影响AAV的转染效率(如pAAV-IRES-HnGFP质粒说明书中推荐插入片段常不超过1 700 bp)。本实验研究采用Stratagene公司AAV Helper-Free System腺相关病毒包装试剂盒(即包括AAV-RC、AAV-Helper两种质粒)和自行构建的含全长膜型Klotho cDNA及HnGFP的pAAV/mKL三种质粒共转染AAV-293细胞、包装病毒时发现该试剂盒所推荐的2×HBS+0.3 mol/L CaCl2对本实验转染细胞存活率影响较大，为此，本研究通过探索、优化和筛选转染条件，最终确定采用 Lipofectamine 2000介导转染方法，能得到显著提高其转染率及包装效率，为本研究实验顺利进行提供了技术方法。

近年来，学者对基因治疗心血管性疾病进行了较多研究〔8〕，而病毒载体的选择对后续基因治疗研究也致关重要。如腺病毒载体因为其最大可携带7.5 kb的外源基因，转染效率高、靶器官广泛等优点应用最多;但是腺病毒载体转染的基因表达时间短，大约为2～3 w，免疫反应大，不适合慢性疾病的防治。而腺相关病毒因为能定点整合到宿染色体19q13.3的特定DNA上，其携带的外源基因表达稳定，持续时间长，具有广阔的宿主细胞谱〔9〕，且引起免疫反应轻〔10〕。

本实验选择腺相关病毒为后续基因治疗的载体，通过克隆获得编码小鼠全长mKL的cDNA片段，并将其装载至腺相关病毒载体之中，获得了含超长cDNA片段的rAAV/mKL病毒载体;并通过病毒转染细胞验证其具有表达Klotho mRNA及蛋白功能，这为构建rAAV/mKL载体应用于高血压、糖尿病、骨质疏松等衰老相关疾病中的干预研究提供了技术条件及实验依据。

1 Chen CD，Podvin S，Gillespie E，Leeman SE，Abraham CR.Insulin stimulates the cleavage and release of the extracellular domain of Klotho by ADAM10 and ADAM17〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(50)：19796-801.

2 Bloch L，Sineshchekova O，Reichenbach D，Reiss K，Saftig P，Kuro-o M，Kaether CKlotho is a substrate for alpha-，beta-and gamma-secretase〔J〕.FEBS Lett，2009;583(19)：3221-4.

3 Torres PU，Prié D，Molina-Blétry V，et al.Klotho：an antiaging protein involved in mineral and vitamin D metabolism〔J〕.Kidney Int，2007;71(8)：730-7.

4 Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，et al.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999;104：229-37.

5 Liu H，Fergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging〔J〕.Science，2007;317：803-6.

6 Yuhong Wang，Zhong jie Sun.Klotho Gene Delivery Prevents Progression of Spontaneous Hypertension〔J〕.Hypertension，2009;54：810-17.

7 赵景宏，王军平，陈 默.编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(19)：2452-5.

8 Jones WS，Annex BH.Growth factors for therapeutic angiogenesis in peripheral arterial disease〔J〕.Curr Opin Cardiol，2007;22(5)：458-63.

9 《中国组织工程研究与临床康复》杂志社学术部，基因治疗及转基因技术与组织工程〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2010;12(24)：4484-5.

10 Barquinero J，Eixarch H，Perez-Melgosa M.Retroviral vectors：new applications for an old tool〔J〕.Gene Ther，2004;11(Suppl1)：3-9.

Construction of the express system carrying the full length cDNA fragment coding mouse membrane-form klotho protein and its application

LI Bao-Shan，WANG Yan-Jiao，MA Hou-Xun，et al.
Department of Gerontics，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Unversity，Chongqing 400016，China

Objective To clone the full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho(mKL)protein and construct the recombinant adeno-associated virus(rAAV)vector carrying the open reading frame(ORF)of the membrane form Klotho protein(pAAV/mKL)and package the virus.The expression of Klotho mRNA and Klotho protein in 7901 cell was tested after rAAV/mKL transfection.Methods The full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho protein was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).After digestion，ligation and transformation，the targeted cDNA fragment was sub-cloned into pAAVIRES-hnGFP vector in order to construct the recombinant plasmid pAAV/mKL.The pAAV/mKL was verified by restricted digestion and DNA sequencing.Use the AAV-293 cell to package rAAV/mKL and later transfect it into the 7901 cell.Then detect the expression of Klotho by RT-PCR and ELISA.Results The cDNA fragment with 3 064 bp coding membrane form Klotho protein was obtained by PCR amplification，the sequence of it was identical by GenBank.The rAAV/mKL was packaged in AAV-293 cell successfully.After transfection by rAAV/mKL，the expression of Klotho mRNA in 7901 cell was increased，and Klotho protein in the supernate of cultured cells significantly upregulated(P＜0.01).Conclusions The rAAV/mKL carrying the full length of cDNA fragment which coding mouse membrane form klotho protein is successfully constructed and packaged in AAV-293 cells，and transfecting it into the 7901 cell verifies it's function of gene express.All of these will pave a road for the deep research of gene therapy for aging related diseases.

Klotho;Gene clone;Adeno-associated virus;Vector construction;Virus package

R393

〕 A

1005-9202(2012)02-0291-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.02.033

国家自然科学基金面上项目(30672212);重庆市卫生局医学科研计划项目(No.2010-2-079)

马厚勋(1966-)，男，教授，主任医师，主要从事老年心血管病基础与临床。

李宝善(1984-)，男，在读硕士，主要从事老年心血管病基础与临床。

〔2011-08-09收稿 2011-11-17修回〕

(编辑 曹梦园)