金银花提取物及主要成分对药物代谢酶CYP3A4的活性抑制作用研究

徐文 孙术红 刘涛 马敏 隋忠国

（青岛大学医学院附属医院药学部，山东 青岛266002）

药物的体内转化依赖于体内的药物代谢酶。细胞色素P450，又称为细胞色素P450 混合功能氧化酶系（简称细胞色素酶或CYP），是人体内最重要的药物代谢酶，参与绝大多数药物和部分内源性物质的体内代谢[1-3]。其中，CYP3A4约占人肝脏中细胞色素酶总量的30%，肠道中细胞色素酶的70%，参与约一半上市药物的体内代谢[4]。该酶的活性容易受到抑制，导致底物药物的吸收增加或代谢变慢，加重毒副作用。西药在研发阶段必须考察对药物代谢酶的诱导和抑制作用，以确保临床合理用药[5]；中药在这方面的研究很少且更易对药物代谢酶产生影响，因此，为保证临床安全用药，有必要研究其对药物代谢酶的作用[6-7]。

金银花是一种常用中药，其提取物及复方制剂在抗菌、抗病毒方面有很强的活性且不易耐受[8-9]，但在临床使用时多与化学药物联用，其中不乏CYP3A4 的底物药物，如克林霉素、林可霉素、夫西地酸钠、利福平、克拉霉素等。金银花是否会导致药物相互作用还未见报道。本文研究了金银花提取物及其3 个主要成分（绿原酸、咖啡酸和芦丁）对CYP3A4 的活性影响，为临床合理用药提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

金银花（由本院采购办公室采购，产地山东，经本院于良生主管药师鉴定为正品）；rhCYP3A4、1′- 羟基咪达唑仑、葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶, 葡萄糖-6- 磷酸（Sigma 公司）；替硝唑、绿原酸、咖啡酸和芦丁（原中国药品生物制品检定所）；氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）（Fluka 公司）；咪达唑仑注射液（江苏恩华药业集团有限公司）；乙腈，色谱纯（德国Merck 公司）；甲酸，色谱纯（美国Tedia 公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

美国Agilent 6410B 三重四级杆液质联用系统，配有G1311A 四元泵、G1322A 真空脱气 机、G1329A 自动进样器和G1316A 柱温箱，使用Mass Hunter 软件控制系统及数据处理；色谱柱为美国Agilent ZORBAX SB-C18(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱。

2 实验方法

2.1 金银花提取物的制备

取金银花100 g 加水1 L 浸渍30 min，煎煮1 h，再加水1 L，煎煮1 h，分次滤过，合并滤液，浓缩至100 mL，放冷至40℃，缓缓加入乙醇使含醇量达75%，充分搅拌，静置12 h，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，加入3 ～4 倍量水，调pH 至7.0，充分搅拌并加热至沸，静置48 h，滤取上清液，浓缩至100 mL)，放冷至40℃，加入乙醇使含醇量达85%，静置12 h，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，备用。

2.2 还原型辅酶Ⅱ（NADPH）生成系统的配制

将葡萄糖-6- 磷酸、NADP+和葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶加入到20 mmol/L 氯化镁溶液中，浓度分别为40 mmol/L、4 mmol/L 和3.2 U/mL。该溶液分装后置于-20℃备用。

2.3 rhCYP3A4 的孵化

反应体系中先分别加入rhCYP3A4、探针底物咪达唑仑和待测药物，置于37℃水浴中预孵化5 min，加入NADPH 生成系统启动反应。在反应体系中，rhCYP3A4、咪达唑仑、NADP+、氯化镁、葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶、葡萄糖-6- 磷酸的浓度分别为50 nmol/L、5 μmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、0.8 U/mL 和10 mmol/L。37℃水浴振荡反应5 min后，加入冰乙腈（含内标替硝唑1 μg/mL）终止反应。涡旋混合1 min，10 000×g 离心5 min，取上清液10 μL 加入液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）系统测定咪达唑仑代谢产物1′- 羟基咪达唑仑的浓度。

实验均为双样本分析取平均值。每批实验均设不加待测药物的阴性对照，即以加入等体积的溶剂替代待测药物，加入待测药物后生成的代谢产物的浓度与阴性对照相比，即可估算出待测药物对药物代谢酶活性的影响。

2.4 LC-MS/MS 测定1′- 羟基咪达唑仑的色谱和质谱条件

6410B 三重四级杆液质联用仪（Agilent 公司）；ZORBAX SB-C18柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）（Agilent 公司），流动相为乙腈-水-甲酸（40∶60∶0.3），流速0.3 mL/min，柱温35℃，进样量10 μL；质谱使用ESI 源，正离子模式，喷雾电压4 000 V，源温度105℃；雾化气为氮气，雾化压力40 psi；去溶剂气为氮气，温度350℃，流速10 L/min；碰撞气为高纯氮气，压力0.1 MPa；质谱的半峰宽均为0.7 amu。采用多反应监测（MRM）模式对药物离子浓度进行测定，m/z342.2 →324.2监测1′-羟基米达唑仑,m/z248.2 →121.1 监测替硝唑。

2.5 抑制作用强弱和作用类型判断

在孵化体系中加入不同浓度的待测药物，分别求得其抑制率，回归计算IC50值。药物对CYP3A4 的抑制作用用1′- 羟基咪达唑仑生成速率的降低来表示，以溶剂对照时1′- 羟基咪达唑仑的生成速率为100%，加入待测药物后1′- 羟基咪达唑仑的生成速率为剩余活性，本实验用后者与前者的比值即剩余活性百分率表示药物对酶活性抑制作用的强弱，数值越低表示抑制作用越强。

抑制作用类型的判断则采用固定待测药物浓度（接近IC50值），改变预孵化时间和探针底物加入顺序，即先加入待测药物、NADPH 生成系统分别预孵化5、10、20、30 和60 min 后加入探针底物（咪达唑仑），其余操作不变。如果药物的抑制作用不受孵化时间的影响则为非抑制作用；如果抑制作用随孵化时间的延长而增加则为不可逆抑制作用。

3 实验结果

3.1 不同浓度的金银花提取物、绿原酸、咖啡酸和芦丁对CYP3A4 的抑制作用见图1，其中金银花提取物的浓度单位mg/mL 是指每毫升中相当于原药材的质量。

图1 金银花提取物（A）、绿原酸（B）、咖啡酸（C）和芦丁（D）对CYP3A4 的抑制作用量效曲线

由图1 可见，所测定的金银花提取物及其3 个主要成分均对CYP3A4 有一定的抑制作用，且随着孵育体系中药物浓度的升高，抑制作用增强（CYP3A4 的剩余活性下降）。抑制作用的IC50值分别为2.13 mg/mL（金银花提取物）、28.8 μmol/L 绿原酸）、74.06 μmol/L（咖啡酸）和17.6 μmol/L（芦丁）。咖啡酸的抑制作用很弱，几乎不会导致药物相互作用，故不进行下一步研究。

3.2 抑制类型判断

不同预孵化时间对绿原酸和芦丁抑制作用的影响见图2。

由图2 可见，在5 ～30 min 预孵化时间内，绿原酸的抑制作用迅速增加，继续延长预孵化时间，对酶活性的抑制作用略增加，可见绿原酸对CYP3A4 有不可逆抑制作用；芦丁对CYP3A4 的抑制作用受预孵化时间的影响与绿原酸类似，也是不可逆抑制作用。

图2 预孵化时间绿原酸（A）和芦丁（B）对CYP3A4 的抑制作用的影响

4 讨论

药物对药物代谢酶的作用包括抑制作用、激动作用、诱导作用和表达下调作用，其中最常发生的抑制作用分为可逆抑制与不可逆抑制，而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制等[10]。对于可逆抑制，当提高底物药物的用量时，这种相互作用可部分抵消甚至完全抵消；而对于不可逆抑制，则是药物代谢酶完全失活，药物代谢酶作为一种特殊的蛋白质需要机体重新合成才能发挥作用，这个过程需要几天的时间，所以此类药物相互作用即使两药间隔数天服用也可能发生[11]。

目前对于中药抑制作用的强弱还没有公认的判断依据，本研究暂按化学药物的抑制作用的判断标准对药物相互作用进行预测。一般化学药物的抑制作用的IC50低于1 μmol/L容易导致药物相互作用；1 ～10 μmol/L 之间可能会导致药物相互作用；大于10 μmol/L 不容易导致药物相互作用。但是对于不可逆抑制，10 ～50 μmol/L 也可能会导致药物相互作用。由此判断，绿原酸和芦丁均有可能导致药物的相互作用。且这些药物的抑制作用相加导致发生药物相互作用的可能性增加。所以，在使用CYP3A4 的底物药物，如克林霉素、他汀类血脂调节药物、环孢素等免疫抑制剂时应避免与含有金银花的药物联用；如果必须联用，应注意这些底物药物的吸收及毒副作用可能增加，且这种相互作用在停用含金银花的药物数天内也有可能发生。

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