国庆1号温州密柑愈伤组织液体悬浮培养过程中生理生化特性研究

蔡小东，李 玲，刘 敏(长江大学园艺园林学院,湖北 荆州434025)

国庆1号温州密柑愈伤组织液体悬浮培养过程中生理生化特性研究

蔡小东，李 玲，刘 敏(长江大学园艺园林学院,湖北 荆州434025)

探讨了液体悬浮培养不同时间的国庆1号温州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)愈伤组织可溶性蛋白质含量、可溶性还原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性的变化。结果表明：可溶性蛋白含量在培养9d时达到高峰，可溶性还原糖含量在培养6d时达到高峰，SOD和POD活性在培养前期活性较低，在培养第9d达到高峰。可溶性蛋白、可溶性还原糖含量与这2种酶的活性变化趋势相近，由此表明在愈伤组织液体悬浮培养过程中，这些物质含量或活性的变化可为确定柑橘愈伤组织液体悬浮培养最佳继代周期提供依据。

国庆1号温州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)；愈伤组织；可溶性蛋白质；可溶性还原糖；超氧化物歧化酶；过氧化物酶

植物快繁技术是生物技术中最具实用价值的领域之一[1]。采用组织培养技术进行快繁与育种在许多植物中已经取得一定的成功，其中通过胚状体发生途径(由愈伤组织再分化形成体细胞胚状体)是包括柑橘在内的许多植物再生完整植株的一条有效途径[1]。愈伤组织及其细胞悬浮系遗传背景较一致，来源稳定，且取材不受时间限制，可长期继代保存，是组织培养、原生质体相关操作以及遗传转化等研究的理想起始材料。有关愈伤组织培养过程中相关代谢物质前人已进行了许多研究，植物愈伤组织培养以及悬浮细胞生长与代谢特征的相关研究也越来越多[2-5]。本研究通过测定国庆1号温州蜜柑(CitrusunshiuMarccv.Guoqing No.1)愈伤组织悬浮培养不同时间的可溶性蛋白质含量、可溶性还原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性，以从生理生化层次揭示柑橘愈伤组织的生长发育特征，从而确定柑橘愈伤组织悬浮培养过程中继代培养的最佳周期，为利用愈伤组织再生体系进行柑橘快繁或育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

国庆1号温州密柑愈伤组织来源于华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组，现保存于长江大学楚天学者及园艺植物逆境生理实验室。

1.2 试验方法

采用单因素试验设计。先将转国庆1号愈伤组织在MT固体培养基中进行增殖培养，再将约1g愈伤组织转至于液体培养基(MT + 1.5g/L谷氨酰胺 + 0.5g/L麦芽糖提取物(Malt extrat,ME)+ 40g/L蔗糖)中，在摇床转速为110r/min，温度为25℃的条件下进行暗培养；分别在培养后0、3、6、9、12、15d取样，以培养0d为对照，共6个处理，每个处理重复3次。在培养过程中，每次随机取3瓶，每次取得的材料先在液氮中迅速冷冻，再于-70℃的超低温冰箱中保存。15d后全部材料取完再测其代谢指标的含量，每项指标重复测定3次。

1.3 可溶性糖含量的测定

以葡萄糖作标准曲线，采用蒽酮比色法[5]测定液体悬浮培养不同时间的愈伤组织可溶性糖含量。

1.4 可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定

分别取0.4g愈伤组织于预冷的研钵中，加入10ml预冷的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)，在冰浴下研磨成匀浆，10000r/min离心15min，取上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[5]；SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法[6]测定，以抑制NBT光化还原50%的酶用量为1个酶活性单位；采用愈创木酚法测定[6]POD活性，以1min内光密度D470nm变化0.01为1个酶活性单位。

上述各指标测定数据均用SPSS13.0软件处理，以LSD法作多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 可溶性蛋白含量的变化

图1 不同培养时间可溶性蛋白含量的变化

图2 不同培养时间可溶性还原糖含量的变化

由图1可以看出，国庆1号温州蜜柑愈伤组织液体悬浮培养过程中，可溶性蛋白质含量在0～3d开始增加，增加速度较快，在3～6d内大幅度增加，并且在第9d达到最大值，9d以后逐渐下降。

2.2 可溶性还原糖含量的变化

由图2可以看出，国庆1号温州蜜柑愈伤组织液体悬浮培养过程中，可溶性还原糖含量在0～3d开始呈上升趋势，在3～6d急剧上升，增加幅度较大；在培养第6d时增加到最大值，随后又逐渐降低。

2.3 SOD活性的变化

愈伤组织液体悬浮培养过程中SOD活性的变化情况如图3所示。由图3可见，随着培养时间的增加，愈伤组织中SOD活性表现出有规律的变化，呈现低-高-低的变化趋势。在0～3d国庆1号愈伤组织中SOD活性开始增加，增加速度较快，并保持在40～70U/g之间变动；在6～9d增加幅度最快快，并在第9d达到高峰，随后9～12d又逐渐下降，但仍保持较高水平。总体上，愈伤组织在液体悬浮培养过程中，培养前期SOD性较培养后期活性低。

2.4 POD活性的变化

在愈伤组织液体悬浮培养过程中POD活性的变化情况如图4所示。由图4可见，在培养3d内POD活性急剧下降，在第3d达到最小值；3～9d一直呈上升趋势，增长速度较快；在第9d达到最大值，随后P又逐渐下降，在12～15d在18～20U/g FW之间变动，但仍保持较高水平。

3 讨论

很多学者对愈伤组织培养进行了研究。张向前等[7]对枣树的愈伤组织培养的研究表明，蛋白质和糖是愈伤组织细胞生长增殖的基础物质，它们的含量变化趋势是相同的；陈红等[8]对刺梨花药愈伤组织培养过程中生理生化特性的研究也表明这几种代谢物质含量的变化与愈伤组织生长的周期的曲线基本一致。一般而言，在一个培养周期内悬浮培养体系中愈伤组织生长量有一个快速增殖期 [8-10]。本研究中，以MT为培养基进行国庆1号愈伤组织液体悬浮培养所得到的结果与前人的研究结果基本一致[7-10]，即在国庆1号愈伤组织液体悬浮培养过程中，可溶性蛋白与可溶性糖的变化趋势是非常相似的；在培养的第0～3d，可溶性蛋白和可容性糖的含量增长不明显，这可能是愈伤组织适应新的培养环境的结果，其代谢能力较弱；第6～9d迅速增长，第9～12d以后逐渐下降，说明蛋白质和糖正在被迅速地分解利用，从而为愈伤组织的分裂增殖提供能量，也反映出愈伤组织生长速度在这段时间内最快；12d以后，液体培养基中营养成分被逐渐消耗，积累的有害成分逐渐引起愈伤组织的缓慢生长，表现为愈伤组织褐化逐渐加重，需要及时进行继代培养。POD和SOD活性的高低与植物细胞的分化发育、植物体的耐盐性、抗热性和抗病性等方面关系密切[11-13]。本研究中，SOD的活性含量也是处在不断增长状态，0～9d可溶性蛋白和可溶性糖的含量在不断增加，SOD活性含量值也在不断增加，而POD的活性含量在不断下降，其中SOD以第6～9d增长的速度最快，POD在第12d后又开始上升。这说明愈伤组织的分裂和增殖需要蛋白质和糖的快速合成，以提供物质基础。这也反映这段时间愈伤组织生长最快，到第12d后蛋白质和糖的含量在不断的减少后，其活性值也开始慢慢地有所下降。

在植物组织培养过程中常常会出现愈伤组织褐化、不分化或分化率低以及白化苗等问题。通过对植物细胞组织培养物的不同发育阶段保护酶活性及其相关物质含量变化的探讨，为今后选择植物愈伤组织的最适培养条件提供了重要的参考依据，也为有机体的顺利发育探讨提供了有效手段。

图3 不同培养时间SOD活性的变化

图4 不同培养时间POD活性的变化

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Q813.1

A

1673-1409(2012)06-S022-03

2012-05-06

国家自然科学基金项目(30900979)。

蔡小东(1978-)，男，湖北浠水人，博士，副教授，主要从事园艺植物生物技术育种研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.006