盐酸林可霉素与头孢拉定对BALB/c小鼠肠道菌群影响的比较研究

李新莉，吴大畅，张翠丽，辛毅

（大连医科大学生物技术系，辽宁大连1 1 6 0 4 4）

盐酸林可霉素与头孢拉定对BALB/c小鼠肠道菌群影响的比较研究

李新莉＊，吴大畅，张翠丽，辛毅#

（大连医科大学生物技术系，辽宁大连1 1 6 0 4 4）

目的：比较盐酸林可霉素（LIH）与头孢拉定（CED）对BALB/c小鼠肠道菌群的影响。方法：将BALB/c小鼠随机分为LIH（3 3 0 mg·kg－1）组和CED（1 6 5 mg·kg－1）组，每组1 0只，分别灌服相应药物1 0 d，停药7 d，应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，对给药前和给药3、1 0 d以及停药7 d后2组小鼠粪便中的肠道菌群进行相似性、多样性分析及优势条带的序列分析。结果：2组给药前和停药7 d后的肠道菌群结构相似，给药3、1 0 d的肠道菌群结构相似，但2组给药前后菌群结构差异较大。实验期间2组肠道菌群均分为4个菌簇，其中LIH组给药前粪便标本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，给药3 d后卟啉单胞菌成为定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；CED组给药前和给药3 d的粪便标本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，给药1 0 d后卟啉单胞菌成为定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；另2个菌簇在2组给药前后均变化不大。结论：2种药均可杀灭肠道中的定植菌Clostridium carboxidivorans，并在用药过程中产生致病菌卟啉单胞菌，导致肠道菌群失调。

盐酸林可霉素；头孢拉定；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳；小鼠；肠道菌群

盐酸林可霉素（Lincomycin Hydrochloride，LIH），是林可霉素类抗菌药物，对大多数革兰阳性菌有较强的抑制作用[1]。头孢拉定（Cefradine，CED）为第1代头孢菌素，具有抗菌谱广、抗菌作用强等特点[2]。这二者在临床上均可用于治疗呼吸道感染、生殖泌尿道感染及皮肤软组织感染等[3，4]。随着临床的广泛应用，二者的不良反应日渐增多，主要表现为腹泻、肝肾损害、过敏反应等[5，6]。本研究将基于1 6 S rRNA基因的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术应用于肠道微生态学，对DGGE指纹图谱进行相似性、多样性分析及优势条带的序列分析，旨在比较LIH和CED对BALB/c小鼠肠道菌群的影响，为临床合理用药提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JY-SPAT琼脂糖水平电泳仪（君意东方电泳设备有限公司）；Mycycler PCR扩增仪、D-CodeTMDGGE电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

LIH胶囊（批号：H2 2 0 2 2 1 2 6，规格：每粒0.2 5 g）、CED胶囊（批号：H2 0 0 6 3 3 0 8，规格：每粒0.2 5 g）均购自长春迪瑞制药有限公司；E.Z.N.A®粪便DNA提取试剂盒（美国Omega公司）；上游引物 GC-3 4 1 f（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG）（引物5′端粗体部分为4 0 bp“GC夹”）、下游引物5 1 8 r（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG）、ExTaq DNA聚合酶（宝生物工程（大连）有限公司）；琼脂糖凝胶（上海研拓生物科技有限公司）；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素（进口试剂，上海双螺旋生物科技有限公司分装）；去离子甲酰胺（进口试剂，上海艾研生物科技有限公司分装）。

1.3 动物

SPF级BALB/c小鼠，♀，体重1 8～2 2 g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2 0 0 8-0 0 0 2。

2 方法

2.1 分组与处理

小鼠给药剂量按照人临床常用剂量换算。将小鼠随机分为LIH（3 3 0 mg·kg－1）组和CED（1 6 5 mg·kg－1）组，每组1 0只，分别灌服相应药物1 0 d，停药7 d。分别在给药前和给药3、1 0 d及停药7 d后收取每组小鼠粪便，于－8 0℃贮存备用。

2.2 粪便细菌基因组DNA提取

采用E.Z.N.A®粪便DNA提取试剂盒抽提各组小鼠粪便细菌基因组DNA，于－2 0℃贮存备用。

2.3 PCR扩增

细菌微生物区系的变化使用1 6 S rRNA基因V3可变区作为靶标进行扩增。根据参考序列[7]设计上游引物GC-3 4 1 f和下游引物5 1 8 r。扩增体系（2 5µL）为：1 0×ExTaq聚合酶缓冲溶液（含Mg2+）2.5µL，dNTP混合物 4µL，牛血清白蛋白（1 mg·mL－1）2.5µL，2 0µmol·L－1的上下游引物各0.5µL，5U·µL－1ExTaq DNA聚合酶0.2 5µL，3µL总DNA作为模板，去离子无菌水补充体系至2 5µL。PCR反应条件：预变性9 4℃5min；变性9 4℃ 3 0 s，退火5 4℃ 3 0 s，延伸7 2℃ 3 0 s，3 0个循环；最终延伸7 2℃7 min，4℃贮存。取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶

（含溴乙锭0.5 g·mL－1）电泳检测后置于－2 0℃贮存备用。

2.4 DGGE电泳

2.4.1 相似性和多样性分析。对1 6 S rRNA基因的V3可变区的扩增产物进行DGGE分析。DGGE采用8%丙烯酰胺凝胶，2 5%～6 5%（1 0 0%变性梯度包含4 0%（V/V）去离子甲酰胺和7 mol·L－1尿素）变性梯度。电泳温度为6 0℃，以2 0 0 V电压预电泳1 0 min，7 0 V电压电泳4 h。电泳完成后进行硝酸银染色，采用Quantity One 4.6.2软件进行相似性和多样性分析。

2.4.2 优势条带的序列分析。切下DGGE图谱中清晰且亮度高的优势条带，加入2 0µL无菌水、捣碎，4℃过夜、9 0℃浸泡1 0 min，取上清液作模板进行PCR扩增，引物为去掉“GC夹”的3 4 1 f和5 1 8 r，PCR反应体系和条件同“2.3”项。PCR产物由宝生物工程（大连）有限公司测序，所得序列在GenBank数据库中进行Blast对比分析。

3 结果

3.1 DGGE图谱相似性和多样性分析

LIH组和CED组的DGGE图谱存在类似的变化规律，2组小鼠给药前和停药7 d的肠道菌群在种类和数量上有相似之处，给药后小鼠肠道菌群的种类发生变化，数量也明显减少，特别是菌a在灌服LIH 3 d即消失，灌服CED 1 0 d几乎消失；菌b在灌服LIH 3 d明显增多，停药7 d消失，灌服CED 3 d有所增加，停药7 d消失；菌c和菌d在2组给药前、后均变化不大。2组不同给药周期小鼠肠道菌群DGGE图谱见图1。

图12组不同给药周期小鼠肠道菌群DGGE图谱1、2.给药前；3、4.给药3 d；5、6.给药1 0 d；7、8.停药7 dFig 1 DGGE profiles of intestinal bacteria in mice during different administration period 1，2.before medication；3，4.3days of medication；5，6.1 0days of medication；7，8.drug withdrawal for 7 days

通过Quantity One 4.6.2软件分别对DGGE图谱进行UPGMA相似性聚类分析，结果见图2。

由图2可知，LIH组和CED组不同给药周期小鼠均各聚成一簇，表明给药周期相同的小鼠个体差异很小。各组给药前和停药7 d的小鼠肠道菌群结构相似，给药3 d和给药1 0 d的小鼠肠道菌群结构相似，但各组给药前、后菌群结构差异较大。

3.2 DGGE图谱中优势条带的序列分析

通过对DGGE图谱中的优势条带进行序列分析，所得测序结果在GenBank数据库中用Blast进行检索和同源性比较，结果见表1。

由表1可知，菌a与Clostridium carboxidivorans的相似性为9 3%，菌b与卟啉单胞菌（Porphyromonas uenonis）的相似性为9 7%，菌c与拟杆菌（Bacteroides）的相似性为9 6%，菌d与丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的相似性为9 7%。LIH组不同周期的粪便标本，其定植菌发生了变化：给药前的粪便标本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，给药3 d的粪便标本中卟啉单胞菌成为定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；CED组不同周期的粪便标本，其定植菌也同样改变：给药前和给药3 d的粪便标本中Clostridium carboxidivorans是定植菌，给药1 0d的粪便标本中卟啉单胞菌成为定植菌，Clostridium carboxidivorans消失；拟杆菌和丁酸梭菌在2组给药前、后均无明显变化。

图2 LIH组和CED组不同给药周期小鼠肠道菌群UPGMA相似性聚类分析1、2.给药前；3、4.给药3 d；5、6.给药1 0 d；7、8.停药7 dFig 2 Cluster UPGMA similarity analysis of different administration periods in LIH group and CED group 1，2.before medication；3，4.3days of medication；5，6.1 0days of medication；7，8.drug withdrawal for 7 days

表1 DGGE图谱中优势条带的序列分析结果Tab 1 Results of sequence analysis of DGGE dominant bands

4 讨论

抗菌药物是临床治疗感染性疾病的主要药物，但长期大量使用抗菌药物治疗的患者，会导致肠道微生态失调，造成临床伴发性腹泻，引起二重感染症状，给治疗带来困难。

LIH和CED在临床上应用较为广泛，但不良反应也不容忽视，如何在治疗感染性疾病的过程中合理选择抗菌药物，成为医师面临的重要问题。本研究根据DGGE能分离长度相同而序列不同DNA的原理，每一个条带大致与小鼠肠道中的优势菌群相对应，条带越多说明菌群多样性越丰富，染色后条带的强度强则说明该细菌的数量越多，从而反映小鼠肠道菌群的种类和数量。针对使用盐酸林可霉素和头孢拉定时常出现腹痛、腹泻等肠道不良反应，比较二者对BALB/c小鼠肠道菌群的影响，使用基于1 6 S rRNA基因的PCR-DGGE[8]技术，分析分别灌服这2种抗菌药物不同周期时小鼠肠道菌群结构的相似性和多样性，进一步对优势条带进行序列分析，推测出定植菌的改变是导致肠道不良反应的主要因素，且CED对BALB/c小鼠肠道菌群的有害影响小于LIH。

Clostridium carboxidivorans是人和动物体内正常的有益菌群，对多种抗菌药物有较强的耐药性，具有发酵能力，与丁酸梭菌类似[9]。其生长速度快，在代谢过程中产生大量丁酸、醋酸和乳酸等有机酸，加速降低了培养基的pH值，抑制有害菌生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生[10]。卟啉单胞菌为致病菌，具有一系列逃避宿主防御机制及破坏宿主组织的毒性因子[11]，可以引起炎症反应，直接导致抗菌药物耐药性的产生。由此推测，灌服LIH和CED导致小鼠肠道Clostridium carboxidivorans消失、卟啉单胞菌增多，是其引起肠道不良反应的主要因素。

拟杆菌在帮助宿主分解多糖、提高营养利用率、加快肠黏膜的血管形成、维持肠道微生态平衡等方面均有重要作用。丁酸梭菌的生态制剂临床上用于治疗病原菌所致腹泻、肠道易激综合征腹泻及抗菌药物相关腹泻[12]等。本研究中，2组不同周期的小鼠肠道拟杆菌和丁酸梭菌变化不大，因此停药后，菌群失调症状可以自然恢复。

综上所述，LIH和CED均可杀灭肠道中的定植菌Clostridium carboxidivorans，并在用药过程中产生致病菌卟啉单胞菌，导致肠道菌群失调；但CED对肠道菌群的有害影响要小于LIH，停药后由于拟杆菌和丁酸梭菌的作用，失调症状可自然恢复。因此使用以上2种抗菌药物时应严格掌握用药指征，尽量缩短疗程。

[1] 朱建平，张 菁，刘 云.盐酸林可霉素有关物质测定方法的研究[J].中国药品标准，2 0 1 1，1 2（1）：5 4.

[2] 曾 颖，何业华.7厂家头孢拉定胶囊体外溶出度考察[J].中国药房，2 0 0 8，1 9（1 6）：1 2 5 0.

[3] 孙志良，黄兴国，毛学富，等.盐酸林可霉素的体外抑菌及临床疗效研究[J].畜牧兽医杂志，2 0 0 2，2 1（2）：1 1.

[4] 张 伟.头孢氨苄缓释胶囊与头孢拉定胶囊治疗呼吸道疾病的疗效比较[J].上海医药，1 9 9 8，1 9（5）：1 1.

[5] 钟松阳.头孢拉定致1 1 3例不良反应文献分析[J].中国药房，2 0 0 6，1 7（1 7）：1 3 3 4.

[6] 王阳奎，候兰芝.盐酸林可霉素注射液的不良反应[J].药学实践杂志，1 9 9 5，1 3（1）：4 6.

[7] 卢 珊，孙 晖，熊衍文，等.婴幼儿腹泻粪便标本菌群的1 6 S rDNA PCR-DGGE分析[J].中国人兽共患病学报，2 0 0 9，2 5（3）：2 2 5.

[8] McAuliffe L，Lawes J，Bell S，et al.The detection of Mycoplasma（formerly Eperythrozoon）wenyonii by 1 6 S rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis[J].Vet Microbiol，2 0 0 6，1 1 7（2-4）：2 9 2.

[9] 顾 阳，蒋 宇，吴 辉，等.生物丁醇制造技术现状和展望[J].生物工程学报，2 0 1 0，2 6（7）：9 1 4.

[1 0] 谢树贵，戴 青，赵述淼，等.丁酸梭菌对动物致病菌的拮抗作用研究[J].湖北农业科学，2 0 0 7，4 6（3）：4 2 4.

[1 1] 张 结.牙龈卟啉单胞菌与冠心病[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2 0 0 7，1 7（1 2）：7 1 7.

[1 2] 吕建平，徐秀丽，付孟丽.酪酸梭菌的药理作用及临床应用[J].临床合理用药，2 0 1 0，3（2 0）：1 5 9.

Comparison of the Effects of Lincomycin Hydrochloride vs.Cefradine on the Intestinal Bacteria of BALB/c Mice

LI Xin-li，WU Da-chang，ZHANG Cui-li，XIN Yi
（Dept.of Biotechnology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 1 1 6 0 4 4，China）

OBJECTIVE：To compare the effects of lincomycin hydrochloride（LIH）vs.cefradine（CED）on the intestinal bacteria of BALB/c mice.METHODS：BALB/c mice were randomly divided into LIH group（3 3 0mg·kg－1）and CED group（1 6 5mg·kg－1）with 1 0mice in each group.They were given relevant medicine for 1 0days and stopped taking medicine for 7days.The similarity analysis，diversity analysis and the sequence analysis of the dominant bands were carried out in feces collected before and 3，1 0days after mediciation and 7days after drug withdrawal by PCR-DGGE technique.RESULTS：The intestinal bacteria were similar in structures before medication and 7days after stopped taking medicine，and the intestinal bacteria were similar in structures 3 and 1 0days after medication，there was great difference between 2groups before and after medication.During the experiment the intestinal bacteria could be divided into 4clusters.Clostridium carboxidivorans was colonized bacteria in LIH group before medication；Porphyromonas uenonis became colonized bacteria 3days after medication，Clostridium carboxidivorans disappeared.However，Clostridium carboxidivorans was colonized bacteria in CED group before and 3days after medication；and Porphyromonas uenonis became colonized bacteria 1 0days after medication，Clostridium carboxidivorans disappeared.Other 2clusters had no significant change between 2groups before and after medication.CONCLUSIONS：2drugs can both kill intestinal colonized bacteria Clostridium carboxidivorans，induce the generation of Porphyromonas uenonis during treatment and cause enteric dysbacteriosis.

Lincomycin hydrochloride；Cefradine；PCR-DGGE；Mice；Intestinal bacteria

R9 6 5；R9 7 8.1

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 0 8 9-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.0 7

2 0 1 1-0 9-0 5

2 0 1 1-1 0-2 8）