HPLC-MS法测定首乌丸中五种蒽醌类成分的含量

王 玉，李 静，张 莉，曹 玲

(1.江苏省食品药品检验所，江苏 南京 210008;2.中国药科大学，江苏 南京 210009)

首乌丸是由制何首乌、地黄、牛膝、桑葚等十四味中药经提取制成的复方中药制剂，具有补肝肾，强筋骨，乌须发之功效，用于治疗肝肾两虚，头晕目花，耳鸣，腰酸肢麻。何首乌为方中君药，且处方量最大，2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷及大黄蒽醌类成分为其主要有效成分，其中2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有显著的降低血脂、降胆固醇和保护肝脏的作用，蒽醌类成分由于炮制过程中结合蒽醌的减少也主要发挥补益作用。中国药典(2005年版)一部何首乌质量标准中仅对二苯乙烯苷进行定量控制［1］，有报道酸水解样品前后，醋酸镁比色法测定何首乌药材中游离蒽醌和总蒽醌的含量，比较不同产地何首乌中蒽醌类化合物的含量［2］。但比色法操作繁琐，误差较大。在前文采用高效液相色谱法(HPLC)测定首乌丸中大黄素的含量基础上［3］，本实验采用HPLC-质谱(MS)联用法对首乌丸中的五种蒽醌类水解前后含量进行测定，使首乌丸质量评价从单一指标性成分转变为多成分综合指标。

1 仪器和试药

FinniganTMAccela uHPLC/TSQ quantum Access联用系统(含LC泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口的三重四级质谱检测器以及Xcalibur2.0色谱工作站)。

芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品(含量测定用)由中国药品生物制品检定所提供;乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

首乌丸由云南广福药业有限公司、苏州雷允上药业有限公司等提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Luna C18(3μm，150 mm×2 mm)，流动相:甲醇-5 mmol/L醋酸铵溶液(90∶10)，流速:0.2mL/min。

2.2 质谱条件

离子化方式:电喷雾离子化(ESI);选择反应扫描检测(SRM);ESI离子源喷雾电压3 500 V;毛细管温度:300℃;鞘气压力为15 arb，辅助气压力为5 arb，负离子方式扫描。碰撞诱导解离电压分别为大黄酸32 V，芦荟大黄素17 V，大黄素29 V，大黄酚26 V和大黄素甲醚24 V。用于定量分析的离子反应分别为m/z 283.0→183.1(大黄酸)，m/z 269.0→239.0(芦荟大黄素)，m/z 269.0→225.0(大黄素)，m/z 253.0→225.0(大黄酚)，m/z 283.2→240.0(大黄素甲醚)，见图1。

图1 五种蒽醌类化合物的MS图Fig.1 Mass spectra of five phenolic compounds

2.3 样品的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，使成每1mL含大黄酸11.32 ng、芦荟大黄素10.03 ng、大黄素14.94 ng、大黄酚 11.33 ng、大黄素甲醚6.85 ng的甲醇溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，水浴回流1 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌的供试品溶液;再精密量取续滤液10mL，置锥形瓶中，水浴挥干，加2.5 mol/L硫酸20mL，振摇混匀后沸水浴回流1 h，放冷，移至分液漏斗中，酸水液用乙醚提取3次，每次20mL，合并乙醚液，水浴挥干，残渣用适量甲醇溶解，移置10mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为测定总蒽醌的供试品溶液。对照品和供试品的SRM谱图见图2。

图2 五种蒽醌化合物对照品(1)和样品(2)的SRM图Fig.2 SRM chromatograms of five phenolic compounds of chemical reference standards(1)and the samples(2)

2.4 线性关系考察

取大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，用甲醇配制定容，分别稀释使成含大黄酸 1.80，9.10，45.2，226.4，566，1 132，5 660 ng/mL;芦荟大黄素1.60，8.00，40.1，200.6，501.5，1 003 ng/mL;大黄素2.40，12.0，59.8，298.8，747，1 494 ng/mL;大黄酚 1.80，9.00，45，226.6，566.5，1 133 ng/mL;大黄素甲醚 1.10，5.40，27.4，137，342.5，685 ng/mL 的对照品溶液。分别取10μL进样，按2.1项下色谱条件分离和2.2项下质谱条件测定离子流峰面积;以峰面积积分值(Y)为纵坐标，对照品溶液浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。

表1 线性关系测定结果Tab.1 The result of linear test for five phenolic compounds

2.5 中间精密度试验

配制浓度约为200 ng/mL的对照品溶液，按2.4项下操作，分别在日内0，1，3，5，7，10 h 和日间0，1，2，3，5，7d记录样品的离子流峰面积，测定日内、日间变异，结果表明建立的方法精密度好，日内及日间误差(RSD)均小于2%。

2.6 溶液稳定性实验

取样品溶液(云南广福药业有限公司，批号:20051001)在0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h 分别进样10μL，按2.4项下操作，记录样品的离子流峰面积，结果游离大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的峰面积的RSD分别为1.67%，1.48%，1.82%，1.83%和1.78%，总蒽醌测定中大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的峰面积的RSD 分别为1.54%，1.16%，1.44%，1.29%和1.54%。

2.7 重复性实验

取同批样品(云南广福药业有限公司，批号:20051001)，按2.4项下操作，平行测定6份。结果游离大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的含量的RSD分别为1.06%，1.34%，1.52%，0.64%和1.46%，总蒽醌测定中含量的RSD分别为0.83%，1.12%，1.24%，0.56%和1.28%。

2.8 加样回收实验

取已知含量的样品(云南广福药业有限公司，批号:20051001)约0.125 g，平行6 份，精密称定，分别添加精密量取的对照品溶液适量，按2.4项下操作，测定含量并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率测定结果(n=6)Tab.2 The results of recovery tests(n=6)

2.9 样品测定

取本品，按2.3.2项下方法分别制备游离葸醌和总蒽醌的样品溶液，取样品溶液和对照品溶液各10μL，按2.4项下操作，记录样品的离子流峰面积，测定，计算。各厂家所有批号样品水解前后均未检出大黄酸和芦荟大黄素。大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的检测结果见表3。

表3 样品中各成分测定结果(ng/g)Tab.3 The result of determinations for five phenolic compounds

3 讨论

何首乌中蒽醌类化合物分为游离型和结合型两种，结合型具有解毒消肿、润肠通便的功效，游离型具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨等功效。本品选用制何首乌入药，是因为炮制时可以减少结合蒽醌的含量，使补益作用更加突出。故本实验对游离型和总蒽醌类化合物分别进行了测定，通过对游离型和结合型蒽醌类化合物的含量的测定全面控制首乌丸的质量。

首乌丸中制何首乌处方量最大，其中蒽醌类化合物为其主要成分且含量较高，因此选用大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚五种蒽醌类化合物作为多成分指标。在实际样品中未能检出大黄酸和芦荟大黄素，仅在其中一个批号中检出大黄酚，但是在何首乌中这些成分均存在，只是随产地、采收环境等因素而不同，同时考察这些指标是有实际意义的。

首乌丸处方复杂，这五种蒽醌类化合物在HPLC色谱条件下完全分离，故选用HPLC-MS联用法实现了这五种物质的完全分离，并用SRM法进行了定量分析。其中大黄酸的分子离子峰为m/z 283，失去一分子CO2后形成碎片离子m/z 239，进一步失去一个CO形成碎片离子m/z 211，再失去一分子CO形成碎片离子m/z 183;芦荟大黄素和大黄素都含有分子离子峰m/z 269，但是芦荟大黄素失去一分子CO2和一分子CO后分别形成碎片离子m/z 241和225，而大黄素失去一分子CHO后形成一个主要的碎片离子m/z 240;大黄酚中m/z 225为准分子离子峰m/z 253失去中性CO产生的碎片［M-H-CO］－;大黄素甲醚的二级质谱中，m/z 240为准分子离子峰失去一分子CH3后再失去一羰基后的碎片［M-H-CH3-CO］－。

含量测定结果显示，各厂家样品中，五种蒽醌类成分含量存在比较大的差异，有些甚至测不出来，如大黄酸、芦荟大黄素和大黄酚;样品中主要含有大黄素和大黄素甲醚，但大黄素和大黄素甲醚的含量也存在较大的差异。中国药典目前未对首乌丸中蒽醌类成分建立含量测定指标［1］，因此为了保证首乌丸的质量和临床疗效，应建立专属性的测定方法，对此类成分的含量予以控制。

［1］中国药典［S］.一部.2005:122-123，545-546.

［2］左红香，金 勇，尹寿玉.不同产地何首乌中有效成分蒽醌的含量比较［J］.华西药学杂志，2006，21(1):76-77.

［3］李 静，张 莉，曹 玲，等.高效液相色谱法测定首乌丸中大黄素的含量［J］.中国生化药物杂志，2009，30(2):118-120.