北五昧子藤茎三萜抗氧化活性研究

李 斌，李元甦，孟宪军，薛 雪，朱力杰

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161）

北五昧子藤茎三萜抗氧化活性研究

李 斌，李元甦，孟宪军*，薛 雪，朱力杰

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161）

利用乙醇浸提法从北五味子藤茎中提取三萜类化合物，再经初步纯化后，进行三萜的抗氧化活性实验。通过总还原力测定法、Fenton法、改良的邻苯三酚自氧化法、DPPH法、猪油体系抗氧化法，分别对北五味子藤茎提取物的总还原力、羟自由基、超氧阴离子自由基及DPPH自由基的清除能力、过氧化值（POV值）进行测定。结果表明，北五味子藤茎三萜有较好的还原能力；对羟自由基和DPPH自由基有较强的清除作用，且清除率50%所对应的质量浓度IC50分别为0.6mg/mL和0.077mg/mL，但对超氧阴离子自由基清除效果不是很显著；有一定地抑制油脂氧化的作用但弱于抗坏血酸、TBHQ，抗坏血酸对三萜的抗氧化性有协同增效作用。

北五味子藤茎，三萜，抗氧化性

北五味子Schisandra chinensis（Turcz.）baill，木兰科（magnoliaceae）五味子属（schisandra michx.）植物，主要分布于辽宁、吉林、黑龙江等地的一种十分珍贵的药材，以辽宁省所产质量最佳，有“辽五味”之称[1]。《中华人民共和国药典》规定其果实和种子，藤茎均可入药。在国内外一直被用作滋补强壮药和收敛镇咳药[2-3]。三萜类化合物是近几年天然产物开发的热点，三萜及其苷类化合物在植物中分布广泛，如灵芝三萜、人参三萜苷、黄芪三萜苷等[4-6]。据报道从五味子科植物中分到的一些三萜具有抗HIV[7]，抗肿瘤活性，抑制胆固醇生物合成的活性[8]和对白血病P-388细胞有抑制作用[9]。在五味子中发现三萜类化合物，目前仅限于南五味子[10]，而北五味子中三萜类化合物的提取及抗氧化活性的研究还未见报道。在我国，其藤茎仅以调味品应用，而目前科学研究对其藤茎的化学研究较少，仅有少量关于藤茎中木脂素含量的报道。本实验采用乙醇浸提法从北五味子藤茎中提取三萜类化合物，再经初步纯化后，进行三萜的体外抗氧化作用的研究，为其药用和深入开发利用提供了基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

北五味子藤茎 采自辽宁省抚顺市新宾地区（粉碎过60目筛备用），抚顺青松药业提供；猪油 市售新鲜板油熬制；无水乙醇、30%双氧水、三氯乙酸、六氰合铁酸钾、三氯化铁、邻二氮菲、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、邻苯三酚、盐酸、碘化钾、可溶性淀粉、硫代硫酸钠、冰醋酸、三氯甲烷、重铬酸钾、三羟甲基氨基甲烷（分析纯） 国药集团药业股份有限公司；TBHQ 广州泰邦食品添加剂有限公司；DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl） SIGMA。

电热恒温水浴锅、DZF-6050真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣实验设备有限公司；LG10-2.4高速离心机 北京医用离心机厂；TU-1810紫外可见分光光度计 深圳市凯铭杰仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 北五味子藤茎三萜样品的制备

1.2.1.1 提取 通过响应面实验设计，得到最佳提取工艺条件：液料比1∶29，乙醇浓度82%，水浴温度54℃，时间1.3h。准确称取北五味子藤茎粉末20.0g，置于1000mL烧杯中，采用料液比1∶29（m/V）加82%的乙醇，在54℃恒温水浴锅中浸提1.3h。萃取后经抽滤收集滤液，将滤液真空浓缩，即得总三萜粗提液。

1.2.1.2 初步纯化 总三萜粗提液经AB-8大孔吸附树脂初步纯化，去除水不溶性杂质，将纯化液旋转蒸发浓缩至最小体积，真空干燥后，得到北五味子藤茎三萜样品。

1.2.2 北五味子藤茎三萜的抗氧化性能实验

1.2.2.1 还原力的测定 将不同浓度（0.05、0.1、0.5、2、10mg/mL）三萜分别取2.5mL加入试管中，依次加入2.5mL 0.2mo1/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.6）和2.5mL 1%六氰合铁酸钾溶液[K3Fe（CN）6]，于50℃水浴保温20min后，快速冷却，再加入2.5mL 10%三氯乙酸，以3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm处测定其吸光值（A，以蒸馏水作参比），吸光值越大表示还原力越强（实验中样品均用蒸馏水溶解。以VC、VE作为有还原能力的阳性对照，操作同上）[11-12]。

1.2.2.2 羟自由基清除活性的测定 实验分为三组[13]：A0组（不含样品和H2O2）、A1组（不含样品，含H2O2）、AX样品组（含不同浓度样品和H2O2）。取1.5mmol/L邻二氮菲溶液1.0mL，加pH7.4 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液2.0mL，充分混匀后，加1.5mmol/L硫酸亚铁溶液1.0mL，加入样品溶液1.0mL，每加一管立即混匀，加0.01% H2O2溶液1.0mL。反应在37℃恒温水浴中进行，准确反应1h后，在536nm波长处测定吸光度。损伤组中用1.0mL去离子水代替样品溶液；未损伤组中用2.0mL去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。

式中：AX：样品组吸光度；A0：未损伤组吸光度；A1：损伤组吸光度。

1.2.2.3 O2-·清除作用的测定 邻苯三酚自氧化速率的测定[14]：取两只试管，加入pH8.0、2.99mL 50mmol/mL的Tris-HCl缓冲溶液，然后加人10μL 30mmol/L邻苯三酚，空白管用10mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚，迅速摇匀，立即倾入1cm石英比色杯中，在325nm处测定光吸收值，从加入邻苯三酚时开始计时每隔30s读一次，测定4min内每分钟吸收值的变化，要求自氧化速率控制在每分钟的吸收值为0.07。

式中：A1：第1min吸光度；A4：第4min吸光度。

样品活性测定：样品管中再加入邻苯三酚，为消除色素影响，同时在空白管和样品管中加入等量样品液，其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。

1.2.2.4 DPPH自由基清除作用的测定 分别取不同浓度的北五味子藤茎三萜溶液2mL及2mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀后避光放置30min，以乙醇作参比，分别测定517nm处的吸光度AX。同时测定2mL不同浓度测定溶液与2mL乙醇混合后517nm的吸光度A2，再测定2mL DPPH溶液与2mL乙醇混合液517nm的吸光度A1[15]。将根据公式计算其抑制率，抗坏血酸作阳性对照。

式中：AX：加测定溶液后DPPH·的吸光度；A2：测定溶液在测定波长的吸光度；A1：未加测定溶液时DPPH·的吸光度。

1.2.2.5 北五味子藤茎三萜对猪油的抗氧化作用 北五味子藤茎三萜不同添加量的抗油脂氧化性能研究[16]：准确称取一定重量比例（0.02%、0.05%、0.1%）三萜及0.02%TBHQ，分别加入到50g猪油中，剧烈搅拌均匀。同时以不加添加物的油脂作空白。将所有样品放置于烘箱中，用烘箱高温诱导猪油发生过氧化反应，在60～70℃下加速氧化。每隔一定时间搅拌1次，并交换其在烘箱中的位置。每2d取出，按照GB5538-2005碘量法测定过氧化值（POV）。以POV大小表示油脂的氧化速度，进而衡量抗氧化剂的活性。五组实验分别为：空白、0.02%、0.05%、0.1%三萜及0.02%TBHQ。

北五味子藤茎三萜与VC的协同抗氧化作用[17]：选用抗坏血酸为协同增效剂，与北五味子三萜在猪油中进行协同抗氧化实验。五组实验分别为：空白、0.05% VC、0.02%三萜、0.02%三萜+0.05%VC、0.02%TBHQ。

2 结果与分析

2.1 还原力的测定

图1 北五味子藤茎三萜的还原力Fig.1 The reducing ability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill

一般情况下，样品的还原力与抗氧化活性有明显的相关性。从图1可以看出，在一定浓度范围内，北五味子藤茎三萜还原力随其浓度的增加而增强，不同浓度之间北五味子藤茎三萜还原力差异显著，在三萜浓度为0.5mg/mL时，还原能力已超过30μg/mL VC体系和2μg/mL VE体系。结果表明，北五味子藤茎三萜具有还原能力，是良好的电子供应者，具有抗氧化活性的可能。

2.2 对·OH清除作用的测定

利用Fenton反应，检测北五味子藤茎三萜对羟自由基的清除作用，结果如图2所示，北五味子藤茎三萜对羟自由基有一定的清除作用，作用效果与三萜浓度呈量效关系，清除率随着三萜浓度得提高而增大。对照品VC对清除50%·OH所对应的质量浓度IC50为0.692mg/mL，而北五味子藤茎三萜的IC50为0.6mg/mL。

图2 北五味子藤茎三萜和抗坏血酸对羟自由基清除能力Fig.2 The capability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on scavenging hydroxyl radicals

2.3 对O2-·清除作用的测定

利用改良的邻苯三酚自氧化法，检测北五味子藤茎三萜对超氧阴离子自由基的清除作用，结果如图3所示，北五味子藤茎三萜对邻苯三酚自氧化均有一定的抑制作用，超氧阴离子自由基清除率随北五味子藤茎三萜浓度的增加而升高，但清除O2-·的能力低于对照品VC。对照品VC对清除50%O2-·所对应的质量浓度IC50为0.284mg/mL，而北五味子藤茎三萜的IC50为105.676mg/mL（以样品浓度与清除率作图，根据拟合方程求出清除率为50%所需样品的浓度，即半抑制浓度IC50）。

图3 北五味子藤茎三萜和抗坏血酸对超氧阴离子自由基清除能力Fig.3 The capability of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on scavenging superoxide anion radicals

2.4 对DPPH自由基清除作用的测定

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，当有自由基清除剂存在，由于其单电子配对而使其颜色由深紫色褪至黄色，其褪色程度与自由基清除能力存在一定的关系，褪色程度越明显，清除能力越强。结果如图4所示，三萜对DPPH自由基的清除能力与加入三萜的浓度相关，加入量越大，清除能力越强。对照品VC对清除50%DPPH·所对应的质量浓度IC50为0.116mg/mL，而北五味子藤茎三萜的IC50为0.077mg/mL。

图4 北五味子藤茎三萜和抗坏血酸对DPPH自由基的清除作用Fig.4 The scavenging effect of triterpene from Schisandga Chinensis Baill and ascorbic acids on DPPH·

2.5 北五味子藤茎三萜不同添加量在猪油中抗氧化效果

实验以抗氧化剂TBHQ为对比组，不加任何氧化剂的空白猪油为对照组，通过烘箱强化氧化检测抗氧化剂对猪油氧化的抑制作用。实验结果如图5所示，所有实验组的POV值均低于空白对照组的值，说明北五味子藤茎三萜对油脂有一定的抗氧化作用。随着三萜添加量的增加，其对猪油的抗氧化作用增强，但抗油脂氧化性能不如TBHQ。

图5 不同北五味子藤茎三萜添加量抗油脂氧化性能Fig.5 Antioxidative activity of different adding amount of triterpene from Schisandga Chinensis Baill

由图6可知，抗坏血酸与北五味子藤茎三萜在猪油中的抗氧化活性有明显的协同作用。当0.02%的三萜与0.05%VC混合后其抗氧化能力最佳，这对于减少合成抗氧化剂的使用量从而减少由此带来的毒副作用具有重要的实际意义。

图6 三萜与抗坏血酸混合使用抗氧化性能的比较Fig.6 Comparison of antioxidative activity of triterpene mixed with ascorbic acids

3 结论

北五味子藤茎三萜具有还原能力，当三萜浓度为0.5mg/mL时，还原能力已超过30μg/mL VC体系和2μg/mL VE体系；对·OH和DPPH自由基有较强的清除作用，清除率随其质量浓度的增加而提高，且清除率50%所对应的质量浓度IC50分别为0.6mg/mL和0.077mg/mL；对邻苯三酚自氧化均有一定的抑制作用，超氧阴离子自由基清除率随质量浓度的增加而升高，但清除O2-·的能力低于对照品VC，北五味子藤茎三萜的IC50为105.676mg/mL；有一定的抑制油脂氧化的作用但弱于抗坏血酸、TBHQ，抗坏血酸对三萜的抗氧化性有协同增效作用。

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Study on antioxidant activity of triterpenes from caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill

LI Bin，LI Yuan-su，MENG Xian-jun*，XUE Xue，ZHU Li-jie
（College of Food，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

By means of ethanol extraction，triterpenes was extracted from caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill.After initial purification，antioxidative activities of the triterpenes were experimented.The antioxidative activities of ethanol extracts were evaluated using various established in vitro systems，including total reducing power，superoxide/hydroxyl/DPPH radical-scavenging assays and the POV value.The experimental results showed that triterpenes had better reducing power，stronger antioxidation effect on the·OH and DPPH·，and the quality concentration 50%（IC50）was 0.6mg/mL and 0.077mg/mL to inhibit.It had less effect on inhibiting O2-·.Triterpenes could inhibit peroxidation of lard，and have less effect of lard peroxidation than VCand TBHQ.Triterpenes exhibited remarkable synergistic antioxidation activity in lard by adding VC.

caculis of Schisandra Chinensis（Turcz.）baill；triterpenes；antioxidative activities

TS201.1

A

1002-0306（2012）03-0121-04

2010－12－31 *通讯联系人

李斌（1979-），男，博士，主任，主要从事功能食品的活性成分提取方面研究。

沈阳农业大学青年教师基金（20101007）；辽宁省教育厅科研研究一般项目（2011）。