脊髓中S100b基因的表达模式研究

黄 浩，赵晓枫，邱猛生

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

脊髓中S100b基因的表达模式研究

黄 浩，赵晓枫，邱猛生

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

S100b是一种钙离子结合蛋白，与阿尔兹海默症、帕金森症、神经痛等多种神经系统疾病有关.实验通过原位杂交和免疫荧光技术对S100b在中枢神经系统的表达模式进行直接分析，发现S100b主要表达在脊髓灰质星形胶质细胞和脊髓白质中正在成熟的少突胶质细胞中，表明其并不能很好的作为星形胶质细胞的分子标记物.

S100b；星形胶质细胞；少突胶质细胞；脊髓

0 引 言

S100b(S100 protein, beta polypeptide, neural)[1]是一种具有EF-手构象的Ca2+结合蛋白，通过二硫键形成同源二聚体[2-3]，而且这种二聚体的形成对其神经营养功能的发挥是必须的[4].将形成二硫键的半胱氨酸残基突变，可以诱发中枢神经系统(The central nervous system，CNS)中星形胶质细胞(Astrocytes)和小胶质细胞(Microglia)的炎症应答反应[5].有些研究结果显示S100b能够结合p53并抑制其转录活性，与星形胶质细胞瘤、原发性恶性黑色素瘤等癌症的发展有关[6-7].在神经系统中，研究表明S100b与多种中枢神经系统疾病以及神经系统损伤有关[8].Liu J等人[9]发现过表达S100b会导致小鼠的运动协调能力下降，5-羟色胺水平下调，而多巴胺水平上升， 说明S100b可能与帕金森症的发病机制有关；类似的研究表明S100b与阿尔兹海默症[10-11]和神经痛[12]等神经系统疾病相关.小鼠S100b基因的敲除能够增强免疫反应性，诱发慢性的胶质过多症[13]，增强癫痫发生[14]等.另一方面，S100b在中枢神经系统的功能具有双重性，在中枢神经系统损伤后的炎症应答反应中，S100b作为神经营养因子促进神经元存活；而当活化的胶质细胞过量分泌S100b时，又会引起神经炎症反应和神经元功能紊乱[15-16].

脊椎动物中枢神经系统主要有神经元、少突胶质细胞(Oligodendrocytes，OLs)、星形胶质细胞和小胶质细胞几种细胞，其中神经元负责神经冲动的产生和传导，少突胶质细胞负责围绕神经元轴突形成髓鞘并几十倍的加快神经冲动的传导速度，小胶质细胞参与免疫，而星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多、功能最复杂的细胞类型.但是，由于星形胶质细胞标记物的缺乏使得对其发育的研究受到一定限制.S100b一直以来在发育生物学中被广泛用作星形胶质细胞的标记物[17-20].但是，很多证据表明S100b不只在星形胶质细胞中表达，而且也在少突胶质细胞中表达.例如，Hachem S等人[21]利用S100b-EGFP品系小鼠发现S100b和少突胶质细胞的标记分子Olig2、O4、GalC、NG2、CNP表达在相同的细胞中，而Deloulme J C等人[22]也发现S100b表达在分化的少突胶质细胞细胞核中，但在已经形成髓鞘的少突胶质细胞中表达量降低，而且在缺乏S100b的髓鞘损伤后的再生过程中以及S100b-/-突变小鼠中，少突胶质细胞的成熟都明显延迟，这说明S100b确实表达在正在成熟的少突胶质细胞中，并促进少突胶质细胞相应的发育过程.但是，S100b在中枢神经系统尤其是脊髓中各种类型细胞中的表达模式并没有被完整的分析.实验通过原位杂交和免疫荧光实验确认了S100b在脊髓灰质中的星形胶质细胞和即将或正在成熟的少突胶质细胞(主要分布在脊髓白质)中的表达，说明S100b并不能作为单纯的星形胶质细胞的分子标记物，而只是在部分星形胶质细胞和特定发育阶段的少突胶质细胞中表达.

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠不同时期的脊髓组织分离后在4%多聚甲醛(PFA)溶液中4 ℃固定过夜，之后换入20%蔗糖溶液4 ℃浸泡过夜后，包埋后放-80 ℃保存.切片厚度原位杂交实验为18 μm，免疫荧光实验为14 μm.

1.2 原位杂交

将小鼠脊髓组织冰冻切片18 μm，贴在载玻片上，50 ℃烘干15 min，依次浸泡4%PFA，20 min；1×PBS，5 min；2 μg/mL蛋白酶K溶液，10 min；4%PFA，10 min；1×PBS，5 min；1×TEA溶液，10 min；1×PBS，5 min，室温预杂交1 h，加RNA探针65 ℃杂交反应过夜；然后在65 ℃的0.2×SSC溶液中洗1 h，转入pH7.4的0.1 M Tris缓冲液中10 min，用绵羊血清封闭后加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体4 ℃孵育过夜；取出后在pH7.4的0.1 M Tris缓冲液浸泡1 h，再在含Mg2+和底物NBT/BCIP的pH9.5的0.1M Tris缓冲液中反应显色；显色完成后甲醇中脱色处理后封片拍照.将S100b基因cDNA序列的70 bp～1490 bp克隆到pT7T3D-PacI载体中，通过体外转录得到S100b的探针.

1.3 免疫荧光

切好的片子放入1×PBS，每次5 min，3次，5%山羊血清室温封闭30 min，加入按比例稀释的一抗，4 ℃过夜反应；片子取出后放入1×PBS，每次5 min，3次，再加入荧光标记的二抗，室温孵育1 h；1×PBS，每次5 min，3次后封片拍照.抗体为anti-S100b(Abcam，AB15520)，anti-GS(Chemicon，MAB302)，anti-GFAP(Millipore，AB5804)，anti-NeuN(Millipore，MAB377)，anti-Sox10(由Michael Wegner赠送)，anti-CC1(Abcam，AB16794).

2 结果与分析

2.1 S100b在脊髓中的表达模式

为了探究S100b在脊髓中的表达模式，购买了S100b的抗体，通过免疫荧光技术检测S100b在小鼠各个不同发育时期的脊髓中的表达.

结果发现，S100b在胚胎期13.5 d(受孕后13.5 d，E13.5)时在脊髓及其周围组织的表达都不明显(如图1.A)，而E14.5时就开始在脊髓侧边的背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)细胞(如图1.B(红色箭头) ，图1.B-B)和脊髓外围的脊椎骨细胞(如图1.B(白色箭头))中高表达.这一结果暗示S100b可能调控这些DRG神经元的发育过程而参与机体感觉的形成过程，再考虑到S100b对Ca2+代谢的调控功能，S100b可能和骨质形成有关.

在脊髓中，S100b的表达在胚胎期E16.5才开始出现，主要在脊髓的腹侧中央的部分神经上皮细胞以及少量刚迁移出不远的细胞中表达；在随后的发育时期，这些细胞不断产生和增殖，到E18.5时，这些细胞虽然还是主要分布在脊髓的腹侧区域，但数量逐渐增多，并开始在脊髓边缘的白质中大量出现；直到出生后第7 d(P7)，这些细胞便在脊髓的各个区域都有分布，表达量也较高；而在出生后两周左右(P15)，少突胶质细胞基本都已成熟，S100b的表达也相应开始下调.即S100b只在小鼠出生前后一段时期内在脊髓中高表达(如图1.C～1.H).

图1 S100b在不同发育时期小鼠脊髓中的表达模式Fig. 1 The expression pattern of S100b gene in mouse spinal cords of different stages

图2 S100b蛋白和mRNA原位检测的一致性Fig. 2 S100b proteins have the same in situ pattern with S100b mRNA

但是，在此也发现实验结果和有些报道的结果有不一致的地方[18-19]，这可能是由于所使用的S100b抗体不同的原因.因此制备了S100b的RNA探针，通过原位杂交技术原位检测S100b基因mRNA的表达.结果表明检测S100b mRNA的表达与免疫荧光实验直接检测S100b蛋白的表达模式是吻合的；同时也购买了另一个公司的S100b抗体做相同的检测，同时在其他人已发表的论文[23]中也有和我们一致的结果(如图2).这说明我们的S100b的抗体是正确的，结果是可靠的.

2.2 S100b不在神经元中表达

为了检测S100b是否在脊髓神经元中表达，我们用神经元特异性表达的蛋白NeuN标记神经元，发现除了脊髓腹侧个别体积较大的运动神经元弱表达S100b外，其他的神经元均不表达S100b(如图3).这一结果与之前的报道是一致的.

图3 脊髓神经元细胞(特异性表达NeuN)不表达S100bFig. 3 Neurons specifically marked by NeuN do not express S100b in spinal cord

2.3 S100b只在灰质中的星形胶质细胞中表达

为了分析S100b在星形胶质细胞中的表达情况，利用GFAP标记脊髓白质中的纤维状星形胶质细胞，用GS标记脊髓灰质中的原浆型星形胶质细胞，检测S100b在这两种细胞中的表达，以刚出生时(P0)时期为例，结果如图4.可见脊髓边缘白质中的GFAP+的纤维状星形胶质细胞基本不表达S100b(图4.A～C)，而灰质中GS+的星形胶质细胞高表达S100b，即S100b与GS同时表达在相同的细胞中(荧光重叠后显示为黄色，图4.D～F).这表明S100b并不是表达在所有星形胶质细胞中，只是表达在灰质中的星形胶质细胞中.

图4 S100b不在脊髓白质GFAP+纤维状星形胶质细胞表达而只表达灰质中的GS+星形胶质细胞中Fig. 4 S100b is expressed in gray matter GS+ astrocytes but not in white matter GFAP+ astrocytes in spinal cord

2.4 特定发育阶段的少突胶质细胞表达S100b

由图4.F可以看出，尽管脊髓灰质中表达S100b的细胞大部分为GS+的星形胶质细胞，但是在脊髓边缘的白质中仍然有大量表达S100b的细胞并不是星形胶质细胞(荧光显示为红色)，推测它们是少突胶质细胞.因此用少突胶质细胞特异性表达的标记分子Sox10和正在成熟的少突胶质细胞的标记物CC1与S100b分别共同标记，以P4时期为例，结果如图5所示.Sox10在E12.5少突胶质细胞刚产生时就开始表达，CC1从P0时期开始表达在正在成熟的少突胶质细胞中，而S100b开始表达的时间则位于这二者之间.从图5.C中可以看出，除了脊髓灰质中少量S100b+细胞外，在脊髓边缘的白质中，几乎所有表达S100b的细胞都表达Sox10(显示为黄色)，但表达Sox10的细胞数量比表达S100b的细胞多(只表达Sox10的细胞显示为红色荧光)；由图5.F可见所有表达CC1的细胞都表达S100b.因此，S100b在准备成熟的或者正在成熟的少突胶质细胞中表达.

图5 S100b表达在准备或者正在成熟的少突胶质细胞中Fig. 5 S100b is expressed by the pro-mature and maturing oligodendricytes in the spinal cords

3 结 论

S100b从小鼠E16.5 d开始在脊髓中开始表达，在出生后几天表达量达到峰值，并在出生后大概两周时开始下调.在细胞水平上，脊髓中S100b表达在灰质中的星形胶质细胞以及准备成熟或者正在成熟的少突胶质细胞中，不表达在脊髓白质中的星形胶质细胞和神经元细胞中.因此，S100b并不能作为中枢神经系统中星形胶质细胞特异性的标记分子，而只能作为灰质中的星形胶质细胞和白质中正在成熟的少突胶质细胞粗略的标记物.

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S100bGeneExpressionPatterninSpinalCords

HUANG Hao, ZHAO Xiao-feng, QIU Meng-sheng

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036， China)

S100b is a calcium binding protein implicated in many nervous system diseases, such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Neuropathic pain, etc. The experiment used situ hybridization and immunofluorescence to analyze S100b expression in CNS. The results show that S100b is mainly expressed in the astrocytes of gray matter and the maturing oligodendrocytes in white matter of spinal cords, which indicates that S100b is not a good molecular marker for astrocytes.

S100b; astrocytes; oligodendrocytes; spinal cords

2012-03-26

国家自然科学基金项目(31000488).

邱猛生(1963—)，男，教授，博士，主要从事神经发育生物学研究.E-mail: m0qiu001@yahoo.com

11.3969/j.issn.1674-232X.2012.05.002

Q189

A

1674-232X(2012)05-0391-06