亲和层析法分离纯化油茶籽多糖Ⅰ的研究

王海林 王春艳 谢长林 文 汉

(安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)

亲和层析法分离纯化油茶籽多糖Ⅰ的研究

王海林 王春艳 谢长林 文 汉

(安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036)

根据油茶籽多糖Ⅰ所拥有的特异性磷酸基团，运用固化金属离子亲和层析法获得合适的金属螯合剂，使得具有一定降血脂作用的油茶籽多糖Ⅰ能特异性的被结合到琼脂糖凝胶上，从而获得纯度较高的油茶籽多糖Ⅰ。通过试验对亲和层析法在提取过程中的使用条件进行优化，得到最适pH以及离子类型。此外，试验将传统方法与亲和层析法进行比较，其对油茶籽多糖Ⅰ的纯化效果，尤其在去蛋白方面，后者能更有效地去除油茶籽多糖Ⅰ里残留的蛋白质。

油茶籽多糖Ⅰ 亲和层析 金属离子螯合

植物多糖，又称植物多聚糖，按其在植物体内的功能可分为两类:一是形成植物的支持组织，如纤维素;二是植物的贮存养料，可溶于热水成为胶体溶液，也可借酶水解后释放单糖以供应能量，如淀粉、菊糖等。多糖是一种具有多种生物活性的大分子，不仅是生物的营养成分，也是一种重要的信息或信息分子的受体，参与分子识别、细胞粘着及细胞的防御作用，具有能量储存、结构支持、防御和抗原决定性等功能。随着对传统中药的不断研究，从20世纪70年代开始，陆续有一批活性多糖成分被发现。在研究其功效的过程中，人们惊喜地发现:多糖作为一种几乎无毒副作用的天然提取物，在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等诸多方面都有着独特的功效［1－2］。多糖的研究已经引起国内外广大药物研究开发者的重视，相关研究报告逐年递增。我国目前对生物多糖的研究大部分集中在人参、银耳、黑木耳、刺参和黄芪等名贵中药材［3］，而对于山茶科的植物，尤其是油茶籽多糖的报道则少之甚少［4］。在研究过程中发现，油茶籽多糖Ⅰ具有降血脂和降血糖的双重作用，但在分离的过程中很难得到高纯度的油茶籽多糖Ⅰ。此外，还发现油茶籽多糖Ⅰ具有特异性的磷酸基团(图1、图2)，多糖Ⅰ的曲线与磷酸盐的曲线匹配度很高，因而可以考虑根据油茶籽多糖Ⅰ的特异性磷酸基团，在分离纯化时用亲和层析法。

油茶主要用于榨取茶籽油，而分析榨油后的茶籽饼，其主要成分除含有残留茶油7．45%外，还有茶皂素约 12．8%～13．8%，总糖44．50%(包括淀粉)和浓缩的粗蛋白质约15．94%。因此，对以往大多废弃的茶籽饼进行进一步的研究开发具有重要的意义。以前试验所用的方法虽然能分离出油茶籽多糖Ⅰ，但无法在短时间内获得高纯度的产物，并且传统的Sevage法并不能很理想地将所提取多糖中的蛋白质杂质去除干净，而本实验室通过亲和层析的第一步就能达到比较理想的纯化效果，并且简单易行。为了更好地用更短的时间获得高纯度的油茶籽多糖Ⅰ，本试验研究探索用亲和层析法分离纯化产物，以更大地发挥其药用价值。

图2 磷酸盐标准图

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用到的油茶籽多糖均由安徽农业大学生物化学实验室提供。

MC99－3自动液相色谱分离层析仪:上海沪西分析仪器厂有限公司;722S分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;TU1810型紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;真空冷冻干燥机:北京德天佑科技发展有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 粗多糖溶液的处理［5－9］及层析样品的准备

取粗提的油茶籽多糖加水溶解，因粗提物含有大量色素，故要通过DE－52进行层析处理，以避免色素等杂质对多糖溶液在亲和层析过程中的干扰。以此处理好的粗多糖溶液即为层析的样品。

1．2．2 标准曲线的制作

分别准确吸取葡萄糖标准液(0．1 mg/mL)0、0．05、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mL 于 5 mL 试管中，加水至5 mL，加入蒽酮试剂2．5 mL充分混匀，在沸水浴中加热10 min后取出，流水中冷却20 min后在620 nm波长下，以空白试剂调零，测各管的吸收值绘制标准曲线。

以葡萄糖(Glucose，GLU)与蒽酮反应后的物质在波长为620 nm下所得的吸光值为纵坐标，以葡萄糖的体积为横坐标，作标准浓度葡萄糖曲线(图3)。由图3可知，其回归方程为 y=0．013 6x+0．019 7，R2=0．994 8，式中:y 为 OD620nm，x 为葡萄糖加样量/μg。

图3 葡萄糖标准曲线

1．2．3 亲和层析柱的改装［10］

本试验采用镍离子亲和层析柱进行初步试验，目的是为了找出最佳的金属离子，以增加亲和层析过程中凝胶对目标多糖的吸附量。试验过程中首先用镍离子亲和层析柱处理样品，试验后需更换金属离子，综合考虑用 Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+进行初步试验。在几种金属离子的转换过程中，首先将镍离子亲和层析柱用5倍柱体积的EDTA－Na2溶液将其中的金属离子去除，接着用3倍柱体积的蒸馏水对已去除金属离子的凝胶进行清洗，清洗完毕之后则用欲添加的金属离子的盐溶液(5倍柱体积)进行洗柱，使其中的目标金属离子有效地结合到琼脂糖凝胶上，最后再用5倍柱体积的蒸馏水对已更换金属离子的琼脂糖凝胶进行清洗，此即将亲和层析柱改装完毕。

1．2．4 金属离子螯合后的层析

分别取5 mL已处理过的粗多糖溶液上柱，待柱子平衡后，先用300 mL的蒸馏水进行洗脱，收集洗脱液并浓缩至5 mL;接着再用200 mL磷酸盐缓冲液进行洗脱，并浓缩至5 mL。保留各种亲和层析柱的洗脱液，并在620 nm处测量其OD值。然后利用标准曲线计算出每种金属离子的多糖结合量进行比较。

1．2．5 洗脱时pH和离子浓度的影响

由前一步骤可以筛选出与油茶籽多糖Ⅰ亲和力最好的金属离子，选定金属离子后进行单因素的洗脱条件优化，分别用不同pH的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到最佳离子洗脱剂的最适pH。确定最适pH后再进行离子浓度的试验，以此在最适pH的前提下确定最经济的离子浓度。

2 结果与分析

2．1 粗多糖的预处理

使用DE－52阴离子交换柱，用500 mL的NaCl(3 mol/L)溶液对去离子水进行梯度洗脱后，以每1 mL样品滴加5 mL蒽酮试剂(0．1 g蒽酮+50 mL 80%硫酸)进行比色。以在波长为620 nm下所得的吸光值为纵坐标，管号为横坐标，作出粗多糖洗脱时多糖的分布情况(图4)。

由图4可知，经过DE－52(DEAE－纤维素)柱用500 mL的NaCl(3 mol/L)溶液对去离子水进行梯度洗脱后，目标多糖能够较好地被集中收集，从而达到预处理的目的，尽量减少杂质(如色素)以及一些蛋白质在亲和层析时的影响，以提高试验效率，并为后面的分离纯化提供相对较纯净的多糖样品。

图4 粗多糖过DE－52柱的洗脱情况

2．2 亲和层析检出物质的分析

2．2．1 水洗琼脂糖凝胶时蛋白的洗脱

水洗琼脂糖凝胶时，以灵敏度为0．1 A进行紫外检测，以其OD260值为纵坐标，管号为横坐标作图(图5)。

图5 水洗琼脂糖凝胶时蛋白的洗脱分布

由图5可知，在水洗琼脂糖凝胶时，由于蛋白无法与琼脂糖凝胶螯合，所以水洗时被较快地洗脱下来。由此可知，大多数无法与琼脂糖凝胶结合的物质都会被较快地洗脱下来，从而能够很好地分离目标多糖，减少杂质的影响。

在多糖的分离纯化过程中，去蛋白是相对关键的一步，传统的Sevage法并不能很理想地将所提取多糖中的蛋白质杂质去除干净，而本实验室通过亲和层析的第一步就能达到比较理想的纯化效果，并且简单易行。在该洗脱过程中，洗脱剂是蒸馏水，并不会在目标多糖中引入不必要的杂质。

2．2．2 水洗琼脂糖凝胶时的非目标多糖的洗脱

水洗琼脂糖凝胶后，以每0．5 mL样品滴加2．5 mL蒽酮试剂(0．1 g蒽酮+50 mL 80%硫酸)进行比色。以在波长为620 nm下所得的吸光值为纵坐标，管号为横坐标，作出水洗时非目标多糖的分布情况(图6)。

图6 磷酸缓冲液洗琼脂糖凝胶的非目标多糖

由图6可知，在水洗琼脂糖时，非目标多糖因不能与琼脂糖螯合，一开始就被大量地洗脱下来，从而能够很好地纯化目标多糖。在图6的主峰中，可看到其最大OD值已达近0．5，说明此步骤中很多不能与琼脂糖凝胶结合的多糖被洗脱下来。由于柱体积相对较小，其本身能结合的油茶籽多糖Ⅰ的能力有限，所以在该过程中可能有很多未跟琼脂糖凝胶结合的油茶籽多糖Ⅰ也一同被洗脱下来。

2．3 金属螯合剂的选择

亲和层析的关键是对金属螯合剂的选择，试验分别研究了 Ni2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+等金属离子的洗脱效果。表1～表3中每种柱子的柱体积皆为25 mL，上样量皆为5 mL，上样的多糖质量浓度大约为0．6 mg/mL，洗脱剂皆为pH 6．0的磷酸盐缓冲液(0．2 mol/L)。由表1可明显看出各种不同金属离子对油茶籽多糖Ⅰ的吸附效果各有不同，而其中以Cu2+效果最佳。虽然Fe3+与其他离子相比也有一定效果，但在具体试验过程中发现，Fe3+能使琼脂糖凝胶变成紫色(可能是其与凝胶的某些基团反应)，从而污染了试验材料，使凝胶的重复利用受到影响，故本试验选择的最为理想的金属离子是Cu2+。而由表2、表3也可以明显看出处理3的1%水平跟其余几组差异极显著，故Cu2+为最佳选择。

表1 不同金属离子的洗脱结果

表2 方差分析

表3 差异显著水平

由图3和表1，可以计算得出各种离子亲和层析柱(25 mL柱体积)的多糖吸附量(表4)。运用各种离子进行亲和层析时，在其他因素相同的情况下，Cu2+对多糖的吸附效果最好。Fe3+对多糖的吸附效果虽较好，但其与琼脂糖凝胶结合后没有很好的方法被洗脱下来，不能再次利用，因此不作考虑。其他离子吸附量相对太小，因此最后确定用Cu2+进行亲和层析。

表4 各种亲和层析柱的吸附量

2．4 pH和离子浓度的影响

2．4．1 pH 的影响

运用磷酸盐缓冲液(0．2 mol/L)进行洗脱时，根据磷酸氢二钠(Na2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)混合的比例不同而调节pH，用不同pH的磷酸盐缓冲液对水洗后的琼脂糖凝胶进行洗脱，以此确定最适宜的洗脱pH。以pH的大小为横坐标，OD620为纵坐标，作图7。

图7 水洗琼脂糖柱时pH的影响

由图7可知，运用磷酸盐缓冲液(0．2 mol/L)调节出的不同pH中，虽然每种pH的磷酸盐缓冲液都可以洗脱下目标多糖，但明显pH为6．0时的洗脱能力最好，以此确定用pH为6．0的缓冲液进行洗脱。由表5、表6的分析结果也能进一步确定pH 6．0是最佳的pH洗脱条件。

表5 方差分析

表6 差异显著水平

2．4．2 离子浓度的影响

用磷酸盐缓冲液时，在相同的pH条件下还要考虑离子浓度的影响，即磷酸盐缓冲液在配制时使用不同的浓度，在0．2 mol/L的基础上，又使用了浓度为1/15 mol/L的磷酸盐缓冲液，以此进行比较，试验结果如表7。

表7 离子浓度的洗脱比较

由表7可知，浓度为0．2 mol/L的磷酸盐缓冲液的洗脱能力比浓度为1/15 mol/L的磷酸盐缓冲液的洗脱能力要强，因此选择浓度为0．2 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱。

3 讨论

水洗琼脂糖凝胶后，再用磷酸盐缓冲液洗脱，以此分离多糖Ⅰ，根据以上分析可以看出，在此洗脱过程中可以很好地去除粗提时没有除去的蛋白质等其他杂质，并可将其他多糖很好地分离开，得到相对较纯的多糖Ⅰ，以此达到试验目的。

水洗不同金属离子的琼脂糖凝胶时，在考虑可行性、经济性后，初步确定用Cu2+进行螯合，磷酸盐缓冲液洗脱时初步确定用pH 6．0、浓度为0．2 mol/L的洗脱液。

在使用固化金属离子亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)时，Fe3+分离的效果也很明显，但其在使用时没有很好的方法从琼脂糖凝胶上被洗脱下来，因此，没有考虑用其进行螯合固化洗脱。

在确定用Cu2+后，再进一步试验何种浓度的磷酸盐缓冲液比较适宜对Cu2+进行洗脱，因此又用浓度为1/15 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，以此比较，最后选择 0．2 mol/L。

4 结论

4．1 在粗多糖的预处理中使用DEAE－纤维素层析，效果明显，可以去除粗提物中含有的大量色素以及其他物质。

4．2 亲和层析法在油茶籽多糖分离中作用效果明显，尤其以Cu2+进行洗脱时效果相对最佳。

4．3 在亲和层析时使用pH 6．0、浓度为0．2 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱时效果相对适宜。

4．4 试验目标多糖Ⅰ虽然得到了很好的分离，但仍无法排除有其他多糖的可能性，仍需探索使其获得更高的纯度。

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Study of Affinity Chromatography Used in the Separation and Purification of the Oil of Tea Seed PolysaccharideⅠ

Wang Hailin Wang Chunyan Xie Changlin Wen Han

(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei230036)

The experiment was based on specific phosphate groups of oil tea seed polysaccharideⅠ，the use of solidifying metal ion affinity chromatography to obtain a suitable metal chelating agents，so that the oil a lipid－lowering effect of tea seed polysaccharideⅠ can be integrated into specific agar glucose gel，to obtain high purity of the oil tea seed polysaccharideⅠ．Through the experiments，the affinity chromatography method in the extraction process of the conditions of use was optimized，getting the optimal pH and ion type．In addition，the experiment compared the traditional method with the affinity chromatography method，the purification effect of oil tea seed polysaccharideⅠ，especially in the protein removing，the latter can more effectively remove the residual protein in oil tea seed polysaccharideⅠ．

oil tea seed polysaccharide，metal chelating，affinity chromatography

Q503

A

1003－0174(2012)11－0034－05

2012－02－09

王海林，男，1985年出生，硕士，天然产物与次生代谢

文汉，男，1963年出生，副教授，天然产物与次生代谢