A型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺研究

朱良全，李聪研，蒋玉文，田冬青，孙 晔

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.北京中海生物科技公司，北京 100081)

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，又称魏氏梭菌(Clostridium welchii)，依据其主要致死性毒素与其抗毒素中和试验，可将此菌分为A、B、C、D和E 5个型。其中A型菌能导致人类气性坏疽和食物中毒，也是多种动物疾病的病原菌，如兔、禽及仔猪的坏死性肠炎和肠毒血症［1］。其致病因子主要是α毒素，免疫的关键在于抗毒素［2-4］。

目前，我国A型产气荚膜梭菌病灭活疫苗生产采用的是传统培养基，如厌气肉肝汤和肉肝胃酶(膜)消化汤［5］。该培养基培养厌氧菌效果好，毒力强，但在实际生产中存在以下问题:(1)成分复杂，难以标准化。其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜程度影响大，造成培养基批次间质量不稳定。(2)广谱性高，专一性弱。该培养基适用于多数厌氧菌的培养，有效产毒因子不足。(3)制作繁琐，需经验因素。牛肉及肝处理、煮沸及滤过，胃酶(膜)的活力及消化程度判断，需要较高的经验值。针对上述缺点，本课题组研制成功A型产气荚膜梭菌合成培养基。为进一步明确A型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数，对合成培养基的培养条件、菌株的适用范围及培养毒素的浓缩工艺进行了优化，为我国A型产气荚膜梭菌灭活疫苗大规模生产工艺改进提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 A型产气荚膜梭菌CVCC37株(原C57-1株)、CVCC52株、CVCC2027株、CVCC2030株、CVCC2014株，由中国兽医药品监察所菌种保藏室鉴定、保管和供应。

1.1.2 培养基及溶液 厌气肉肝汤，批号为20091223;肉肝胃酶(膜)消化汤，批号分别为20100105、20100112、20100119;明胶缓冲液(稀释毒素用)，批号为20100201。由中国兽医药品监察所基础保障处提供。

A型产气荚膜梭菌合成培养基:主要成分为蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二钾、氯化钠、生长因子等。批号:201001，由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 实验动物 小白鼠，CD-1品系，16～20 g，SPF级，由北京维通利华实验动物有限公司提供。

1.1.4 浓缩设备 Easy-load蠕动泵，型号为NO.XX80EL230;PERMEATE仪，生产编号:X142POO.80;0.5m2的8 ku及10 ku截留分子量(MW)超滤膜购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 产气荚膜梭菌CVCC37株种子液的制备将A型产气荚膜梭菌(CVCC37)冻干菌种用1 mL肉肝胃酶消化汤稀释后，吸取菌液0.1 mL接种于10 mL的肉肝胃酶消化汤中，置37℃静置培养18～24 h，作为种子液。

1.2.2 菌液的培养 按说明书称取A型合成培养基，用相应体积的去离子水将各成分充分溶解，调pH值至8.3，116℃灭菌30 min，待温度降至室温，将种子液按培养基体积的1%接种，37℃静置培养6 h。

1.2.3 毒素的制备 培养好的菌液以3000 r/min离心 30 min，吸取上清，0.22 μm 滤膜过滤除菌，即为毒素，-20℃冻存备用。

1.2.4 菌液毒力(MLD)的测定 将毒素用明胶缓冲液作适当稀释，使0.2 mL稀释液中分别含有0.01 mL(20 倍稀释)、0.02 mL(10 倍稀释)、0.03 mL(6.6倍稀释)和0.04 mL(5倍稀释)的毒素，各尾静脉注射16～20 g的小白鼠2只，每只0.2 mL，在24 h内全部死亡的最大稀释度乘以5，即为每1 mL毒素所含的最小致死量(MLD)数。

1.2.5 pH值对合成培养基产毒的影响 配制A型培养基溶液各1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液分别调整 pH 值至 7.0、7.5、8.0、8.5 及9.0，116 ℃灭菌 30 min。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4法进行培养及毒力测定，各进行3批，批号分别为A1001、A1002、A1003。

1.2.6 高压灭菌对合成培养基产毒的影响 配制A型培养基溶液各1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液调整 pH值至8.3。分别以116℃灭菌30 min、121℃灭菌 15 min、121℃ 灭菌30 min。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4 法进行培养及毒力测定，共进行3 批，批号分别为 A1011、A1012、A1013。

1.2.7 配制用水对合成培养基产毒的影响 对A型合成培养基分别用去离子水、反渗透纯化水、蒸馏水配制成1000 mL，用2 mol/L氢氧化钠溶液预先调整 pH8.3。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4 法进行培养及毒力测定，共进行 3批，批号分别为A1021、A1022、A1023。

1.2.8 合成培养基培养条件的确定 按说明书配制A型培养基6甁，1000 mL/瓶，将种子液按培养基体积的1%接种，其中1甁置37℃培养20 h，期间分别于4、6、8、10、12、14、16、18 和20 h 先后取样5 mL;另外5 甁，分别置35、36、37、38 和 39 ℃培养6 h 后取样5 mL，然后按 1.2.3、1.2.4 法取其上清进行毒力测定，确定最佳产毒的时间和培养温度。

1.2.9 配制成的培养基与传统培养基对比试验按上述筛选条件配制A型培养基3批，1000 mL/批，批号为 A201001、A201002、A201003，与 3 批肉肝胃膜消化汤进行比较。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4法进行培养及毒力测定。

1.2.10 合成培养基对不同A型菌株的培养试验为确定合成培养基对不同A型产气荚膜梭菌菌株的培养情况，取5株A型产气荚梭菌菌株，菌号分别为 CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，在35和37℃进行培养，分别在5 h和7 h取样，按1.2.3、1.2.4 法取其上清进行毒力测定。

1.2.11 毒素浓缩工艺的优化 配制A型培养基5000～6000 mL，并按上述优化条件培养产气荚膜梭菌CVCC37株，培养好菌液经3000 r/min离心30 min，去除菌体，分别用不同截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行浓缩，然后进行浓缩前、后体积定量，并取浓缩前、后及透出液样品各10 mL按1.2.4法进行毒力测定。

2 结果

2.1 A型产气荚膜梭菌合成培养基pH值、高压条件、培养用水优化结果 从表1-表3看出，最适pH 值范围为8.0～8.5，灭菌条件为116 ℃30 min，配制用水为去离子水。

2.2 不同培养时间及培养温度产毒结果 从表4和表5看出，合成培养基培养CVCC37株6小时后毒力达到50～100 MLD/mL，随着时间的延长，毒力不再增强;培养温度为36℃或37℃，产毒效果最佳。

表1 不同pH值培养基的产毒结果(MLD/mL)

表2 不同高压条件培养基的产毒结果(MLD/mL)

表3 不同配制用水培养基产毒结果(MLD/mL)

表4 不同培养时间产毒结果

表5 不同培养温度产毒结果

2.3 合成培养基与肉肝胃膜消化汤对比结果 从表6看出，A型合成培养基可替代传统培养基。

2.4 合成培养基对不同A型菌株的培养试验结果从表7看出，合成培养基培养A型产气荚膜梭菌CVCC37株产气量最大，毒力最强。

2.5 培养毒素浓缩条件优化结果 从表8看出，10 ku截留分子量的收获率为40%，其透出液静脉接种 0.2 mL，小鼠2/2 死亡;而8 ku收获率达75%，其透出液透出液静脉接种0.2 mL，小鼠0/2死亡;因此8 ku截留分子量的膜包适宜对A型菌培养毒素的浓缩。

表6 合成培养基和肉肝胃酶消化汤毒力比较结果

表7 合成培养基培养不同A型菌株结果

3 小结与讨论

3.1 α毒素是A型产气荚膜梭菌主要分泌毒素，也是主要免疫原，其分子量为42.5 ku。影响α毒素产量因素较多，如菌株类型、菌株毒力、培养时间、培养基pH值、培养温度、培养过程中的溶解氧和培养基组成及各组分的比例等［6］。通过对A型合成培养基使用参数进行试验，确定最适灭菌方式为116 ℃、30 min;pH 值为8.0 ～8.5;配制用水为去离子水;合成培养基培养产气荚膜梭菌CVCC37株在6 h后毒力达到50～100 MLD/mL，随着培养时间的延长，毒力不再增强;当培养温度在36～37℃时，产毒效果最佳。

表8 不同截留分子量膜包的浓缩结果

3.2 该A型产气荚膜梭菌合成培养基专一性强，仅对制苗用标准株产气荚膜梭菌CVCC37株产生较强的毒力，对其余5种菌株产气量小，产毒性能弱。这说明合成培养基的成分与菌株类型、代谢特点密切相关。另外培养基的起始pH值较高，可能是由于pH值降低会对α毒素蛋白酶产生破坏作用。

3.3 A型产气荚膜梭菌培养时间的报道也不尽相同，Gale和Van Heynlngen认为培养4～5 h，α毒素产量最高［6］，也有人认为 8 h 后产毒量最大［7］;郭明章［8］等研究产气荚膜梭菌NJ-l株培养5～6 h的毒素产量最高和活性最强。我们研究结果显示6 h可达最高。同时也证明与菌株活力、培养起始pH值、培养基成分、种子液浓度等有着密切的关系［7］。

3.4 超滤浓缩系统现已广泛应用于兽用生物制品疫苗的生产。A型产气荚膜梭菌培养毒素分别用不同截留量分子的millipore超滤浓缩系统进行浓缩，10 ku分子截留量的收获率为40%，其透出液含毒，且能致死小鼠，8 ku收获率达75%，其透出液中不含毒，因此用8 ku分子截留量的膜包适宜对A型菌培养毒素进行浓缩。另外该试验有效浓缩可达26.6倍，耗时40 min，浓缩倍数远高于报道中 7 倍［9］，适合接种剂量低的禽坏死性肠炎灭活疫苗和多价梭菌灭活苗的研制和生产。另外超滤浓缩，具有样品量大、处理快速、重复利用率高等特点，适合大规模生产。并可克服传统硫酸铵提取工艺中存在的难题:如灭活脱毒菌液经硫酸铵沉淀后，有效成分悬浮于上清表面，粘度大，需用芍捞取或其它方法机械提取，在操作间需曝露并产生粒子、不适于GMP生产［10-11］。另外传统的氢氧化铝胶苗，其吸附效果差，存在有效抗原成分大量流失问题。因而采取浓缩冻干是厌氧菌灭活菌苗生产工艺变革的新趋势。

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［5］中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版［S］.

［6］Gale E F，Van Heyningen W E.The effect of the pH and the presence of glucose during growth on the production of alpha and theta toxins and hyaluronidase by Clostridium welchii［J］Biochem J，1942，36(7-9):624-30.

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